К числу аналитических методов, наиболее широко используемых для контроля качества пищевых продуктов, относится газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием. Идентификация подлинности различного рода продукции и определение ксенобиотиков в биологических объектах являются близкими задачами, поскольку основываются на аналитическом определении набора примесных компонентов, определяющих свойства и/или происхождение объекта исследования.

Наряду с контролем качества пищевых продуктов, существует ряд сходных проблем из различных отраслей человеческой деятельности, для решения которых можно применить близкие методические подходы с целью доказательства принадлежности объекта к определенной общности (группе), основанные на выявлении хроматографических маркеров специфичности этой общности объектов. К числу примеров подобных задач можно отнести установление способа производства алкогольных напитков и идентификации их фальсификатов, а также подлинности лекарственных препаратов. С учётом общемировой тенденции к росту числа фальсификатов наиболее популярной и востребованной продукции, решение подобных задач стало особенно актуальным для современной аналитической химии.

При наличии большого числа аналитических лабораторий, призванных решать подобные задачи, вторым важным моментом является необходимость развития методических подходов, позволяющих унифицировать и автоматизировать собственно хромато-масс-спектрометрический анализ, и создать единый методический регламент, призванный повысить межлабораторную воспроизводимость получаемой аналитической информации.

Целью работы была разработка общих методических подходов для контроля качества алкогольной и фармацевтической продукции на принципах хроматографических методов анализа. Литературный поиск показал, что по маркерному анализу алкоголя работ крайне немного. В основном это описание методик технологического контроля спиртных напитков. Маркерному анализу наркотических веществ посвящены методики Комитета по контролю наркотиков ООН по установлению принадлежности образцов героина к единой массе и работы по идентификации источников нефтяных загрязнений.

Общий подход к анализу спиртсодержащих жидкостей, наркотических веществ дан на схеме 1. Этот подход заключается в следующем. При исследовании спиртных напитков на подлинность система компонентов, характерных для подлинного образца, определяется как набор и соотношение большого количества летучих веществ составляющих букет, маркеров возраста и сопутствующих соединений. Ароматизаторы, разбавители и другие, посторонние для подлинного образца вещества, также являются системой компонентов, указывающих на фальсификацию. Идентификация таких систем компонентов позволяет надежно выявлять суррогатный алкоголь и в первую очередь коньяки и вина. При выявлении суррогатов спиртов-ректификатов и водок установление природы спирта проводили по набору минорных примесных веществ, которые ранжировали по идентификационной значимости. Аналогичный подход по поиску и проверке устойчивости признаков применяли при выявлении новых метаболитов лекарственных препаратов, которые необходимо отличать от компонентов биологической матрицы и продуктов деградации известных исходного вещества и его известных метаболитов.

Еще одной проблемой, решаемой в этой работе, является выявление, разделение и систематизация хроматографических наложений. Практика показала, что хроматографические наложения появляются (даже в несложных органических матрицах) уже тогда, когда количество определяемых компонентов достигает 20-ти.

Несмотря на возможность хромато-масс-спектрометрии детектировать до нескольких веществ в одном хроматографическом пике, селективности этого метода не всегда хватает даже при использовании наиболее современных систем автоматической обработки масс-спектров. Это приводит к получению ложноотрицательных результатов и требует применения предложенных в этой работе подходов: процедуры проверки результатов автоматической идентификации или альтернативных методов хроматографического разделения.

Схема 1. Общий подход к анализу спиртсодержащих жидкостей, наркотических веществ и нефтяных загрязнений

Методы хромато-масс-спектрометрического анализа в химико-токсикологическом исследовании спиртов и летучих ядов [9-21, 51-66]

Выявление и устранение артефактов и хроматографических наложений.

Для анализа спиртсодержащих жидкостей использовали следующую температурную программу: 75°C(1 мин), 10°C/мин, 190°C(60 мин), деление потока 1/12-1/16. Выявлен ряд хроматографических наложений (для фазы FFAP), способных искажать результаты идентификации природы спирта. Это следующие вещества (в скобках даны характерные ионы при совместном определении): ацетон/метилацетат (m/z58/74); бензальдегид/октанол-1 (m/z105/83); этиленгликоль/этилдеканоат/масляная кислота (m/z62/88/60); метанол/трет-бутанол/метилэтилкетон (m/z31/59/72); кротоновый альдегид/толуол (m/z70/91); пропионовая кислота/2,3-бутиленгликоль/3,7-диметил-1,3,7-октатриен (m/z74/90/136); 1.1-диэтоксиэтан/этилацетат(m/z103/88); бутилацетат/1,2-дихлорэтан (m/z73/63), акролеин/метилацеталь (1,1-диэтоксиметан) (m/z56/103), лимонен/диэтилкротональ/ изоамиловый спирт (m/z136/101/70), диэтилфталат/моноэтилсукцинат, этанол/бензол. Для разделения совместно элюирующихся компонентов нами предложен двухканальный хроматограф.

Двухканальный хроматограф для выявления фальсифицированного алкоголя и определения летучих ядов в биологических объектах [8].

При ГХ-МС анализе алкоголя на колонке FFAP не удается разделить идентификационно значимую пару веществ изопропанол/этанол. Разделению этих компонентов мешает вакуум на выходе из колонки, приводящий к уширению пика этанола. Наиболее эффективно удается разделить этанол и изопропанол в спирте при ДИП детектировании. Как показано выше, пламенно-ионизационный детектор неспецифичен и не позволяет определять коэлюирующиеся компоненты, однако это возможно на колонке PORA PLOT Q. Наличие сахара в десертных спиртных напитках не позволяет корректно определять в них состав летучих веществ. Однако, летучие вещества на фоне сахаров возможно корректно определять методом парофазного анализа без термостатирования. Для решения перечисленных выше проблем разработана хроматографическая система, включающая следующие компоненты:

Хроматограф с двумя узлами ввода, двумя пламенно-ионизационными детекторами и масс-спектрометрическим детектором. Каждый узел ввода оснащен автоинжектором с возможностью использования газоплотного шприца и шприца для ввода жидких проб. Канал 1: Колонка HP-FFAP подключена к масс-спектрометрическому детектору. Канал 2: Колонка HP-FFAP и колонка Pora PLOT Q, подключенные к одному инжектору через кварцевый тройник. Каждая из колонок подключена к пламенно-ионизационному детектору.

Нами изучено формирование артефактов и исследование изменения состава градуировочных смесей летучих веществ при хранении. При анализе спиртов и спиртных напитков (коньяков и водок) обнаруживали соединения и группы соединений, не характерные для исследуемых образцов. Часто эти соединения идентифицировали в напитках низкого качества, что могло быть поводом к их использованию в качестве маркеров непищевого или низкокачественного спирта. Для этого необходимо было выяснить, могли ли быть эти соединения артефактами – продуктами распада лабильных компонентов пробы или они могли образоваться при хранении образца. Для этого исследования использовали многокомпонентные смеси летучих кислот, фурановых соединений. Эти образцы хранили при комнатной температуре, и в течение нескольких лет фиксировали изменение их состава. Для исследования деградации сахаров в инжекторе хроматографа анализировали 40%-е водно-спиртовые настои огурца, арбуза, смеси с лактозой, сахарозой и фруктозой, используемые как компоненты рецептур при производстве водок и коньяков. Результаты представлены в табл.1. Наиболее лабильным соединением был кротоновый альдегид, который по нашим данным, трансформируется в диэтилкротональ при хранении.

Таблица 1. Вещества-артефакты, образующиеся при хранении и анализе спиртных напитков и стандартных смесей

Пример хроматографической дифференциации объектов по примесному составу. Различение синтетического спирта и спиртов биохимического происхождения.

Синтетический спирт не разрешен к применению в пищевых и медицинских целях и внесен в Списки сильнодействующих и ядовитых веществ Постоянного комитета по контролю наркотиков. Синтетический этиловый спирт получают гидратацией этилена из попутных нефтяных газов. При синтезе образуется набор примесных компонентов (см. Табл. 2).

Сравнивая набор примесных компонентов синтетического спирта и спиртов, полученных с применением технологии ферментативного брожения (см. табл.3), можно видеть существенную разницу в компонентном составе этих объектов, что и явилось основой методики. Следует отметить, что предложенная методика не позволяет различить пищевой и гидролизный спирт, поскольку примесные соединения в этих спиртах идентичны и формируются в процессе ферментативного брожения. Наиболее сложной задачей является выявление синтетического спирта-ректификата, который содержит ограниченный набор примесных соединений в следовых концентрациях. Для решения этой задачи было исследовано более 300 образцов, из которых была сформирована база ГХ-МС данных и коллекция спиртов различного происхождения.

Критерии выбора и условия детектирования веществ-маркеров синтетического спирта-ректификата.

Для целей идентификации синтетического спирта-ректификата наиболее пригодны такие примесные вещества, которые присутствуют в синтетическом спирте сырце в значительном количестве, являются нехарактерными для ферментных спиртов и трудно удаляются ректификацией и не образуются в спирте или спиртном напитке при длительном хранении. Совокупность идентификационных признаков дана в Табл. 2.

Таблица 2. Содержания (мг/л) летучих компонентов синтетических спиртов и спиртов ферментного брожения из зернового и виноградного сырья

Оценка результатов идентификации.

Спирт-сырец может быть признан синтетическим, если его примесный состав соответствует составу, приведенному в Табл. 1 и 2. Вещества, характерные для синтетического спирта ранжировали по идентификационной значимости (см. Табл. 2) и делили на четыре группы по убыванию вклада в результат идентификации. При исследовании спирта-ректификата образец может быть идентифицирован как синтетический спирт, если он имеет признаки 1 или 2 группы и не менее двух признаков 3 группы. Наличие в образце веществ, отнесенных к признакам 4 группы, не противоречит природе синтетического спирта. Ярким примером признака 4 группы может служить ацетон, по наличию которого этиловый спирт часто ошибочно идентифицируют (согласно ГОСТ), как имеющий непищевую природу. В некоторых спиртах-сырцах из зернового сырья наблюдали лимонен, стирол и вещества пиразинового ряда (2,6-диметилпиразин и 2,3-диметилпиразина, 2-этил-6-метилпиразин, 2-этил-5-метилпиразин, триметилпиразин, 2,6-диэтилпиразин). Эти вещества могут рассматриваться как маркеры нарушения технологии производства спирта.

Таблица 3. Пример ранжирования признаков по идентификационной значимости. Маркеры синтетического спирта ректификата

Факторы, приводящие к ошибочной идентификации этилового спирта, как имеющего непищевую природу. Образование и накопление ацетона и сопутствующих веществ в водке при длительной выдержке.

По существующей практике спирт или водка признаются произведенными из непищевого сырья при обнаружении в них следов ацетона (см. ГОСТ Р 51786-2001). Нами было проведено исследование изменения компонентного состава водки при ее длительной выдержке. После анализа образец водки, произведенный из пищевого спирта, не содержащего ацетон, выдерживали длительное время в герметично упакованной стандартной бутылке. Повторный анализ, проведенный через 2 года, показал образование значительного количества ацетона длительного хранения. Этот результат был подтвержден анализом многих образцов водки после длительного хранения. Можно предположить, что одним из возможных путей образования ацетона может быть окисление изопропанола, которого содержится в водках от 1 до 6 мг/л. Окислителем может служить кислород, растворенный в водной фракции водки. Этот факт не позволяет использовать ацетон как основной маркер природы спирта, поскольку есть вероятность его образования в любых этиловых спиртах. Часто в водках обнаруживают до 8-10 мг/л ацетона, что нельзя объяснить только окислением изопропанола. Поэтому, другим важным источником ацетона в водке может служить деградация сахаров – компонентов рецептур при длительном хранении образца (см. Табл. 1). В наибольшей степени к образованию ацетона склонны водки, содержащие инвертный сахар (данные С.Б. Максимовой).

Химический состав и токсичность образцов нелегальной алкогольной продукции.

Нами проведено исследование химического состава и токсичности образцов суррогатной водки из двух регионов (Тыва и Ставропольский край), самогонов (более 80 образцов из 4-х регионов России), а также образцы этанолсодержащих технических жидкостей. Исследования токсических свойств самогонов проводили на лабораторных животных и использовали биологические экспресс-тесты. Показано, что токсическими свойствами обладают отходы ликероводочной промышленности – денатураты (эфиральдегидные фракции и кубовые остатки ректификации – концентраты сивушных масел). Большинство исследованных нами образцов суррогатов алкоголя из незаконного оборота имеют токсичность сравнимую с токсичностью контрольных образцов, при этом их органолептические свойства, как правило, отрицательны или их токсичность обусловлена веществами неалкогольной природы (этиленгликоль, диэтиленгликоль, метанол, 1,2-дихлорэтан). Полученные результаты позволили сделать вывод о том, что причиной высокой алкогольной смертности в России является не повышенная токсичность суррогатов алкоголя, а негативные социальные факторы, провоцирующие увеличение потребления алкоголя [3].

Проблема выбора и идентификации денатурирующих добавок к этиловому спирту.

Диэтилфталат, наряду с диэтиловым эфиром и кротоновым альдегидом, применялся для денатурации спиртов. Однако диэтилфталат является распространенным компонентом антропогенного в том числе и лабораторного загрязнения, а также легко удаляется ректификацией из этанола. Для дифференциации диэтилфталата, как денатурирующего агента и источника «лабораторного» загрязнения, предложена методика, базирующаяся на дифференциации устойчивого фонового распределения эфиров фталевой кислоты (диизобутилфталата, дибутилфталата, диизооктилфталата) и профилей спиртных напитков содержащих диэтилфталат как денатурирующую добавку. Так, если диэтилфталат обнаруживается в образце в отсутствие других эфиров фталевой кислоты, можно говорить об идентификации его как денатурирующей добавки, в случае, если его концентрация минимальна, по сравнению с другими гомологами, он является компонентом лабораторного или техногенного зпагрчязнения. По нашему мнению, для денатурации можно использовать выявленные нами устойчивые маркеры синтетического спирта (см. Табл. 3.).

Идентификация подлинности коньяков и коньячных спиртов

Эволюция летучих соединений в коньячных спиртах при выдержке и маркеры нарушения технологии коньячного производства.

При выдержке молодых коньячных спиртов состав летучих соединений меняется. В спиртах происходит накопление уксусной кислоты от 35-50 мг/л до 150-450 мг/л, которая частично переходит в этилацетат, наблюдается образование эфиров других летучих кислот, ацеталей, что положительно сказывается на органолептических свойствах коньячного спирта. Аналогичные процессы происходят при изготовлении молодого коньячного спирта из некачественного (скисшего или окисленного) виноматериала. При этом процессы этерификации принимают неконтролируемый характер и органолептические свойства такого напитка отрицательны. Такие образцы обычно разбавляют водно-спиртовой смесью, для устранения негативного влияния этилацетата и уксусной кислоты и добавляют ароматизаторы, что является наиболее распространенными разновидностями фальсификации.

Содержания компонентов коньячных спиртов типичные для отечественных коньяков приведены в Табл. 2. Пример хроматограмм некачественных коньяков приведен на рис.1.

Рис.1. Хроматограммы (ДИП) некачественных коньяков.

1 –ацетальдегид, 3 – метилформиат, 4 – ацетон, 5 – этилформиат, 6 – метилацетат, 8 – этилацетат, 9 – метанол, 10 – метилэтилкетон, 14 – этанол, 16 – втор-бутанол, 17 – пропанол-1, 22 – изобутанол, 24 – изоамилацетат, 25 – бутанол-1, 29 – изоамиловый спирт, , 32 – гексанол-1, 33 – циклогексанол – внутренний стандарт, 35 – уксусная кислота, 36 – фурфурол, 55 – фенилэтиловый спирт, 69 – этилоктаноат, 85 – диацетил, 89 – этиллактат, 90 – ацетоин, 96 – 1,2-пропиленгликоль.

На верхней хроматограмме идентифицированы компоненты-признаки окисленного коньячного спирта: диацетил, ацетоин в концентрации 25 и 280 мг/л, соответственно, а также 1,2-пропиленгликоль – признак добавления ароматизатора. На нижней хроматограмме наблюдается занижение концентраций всех летучих компонентов в 2.5-3 раза по сравнению с типичными для отечественных коньяков, что свидетельствует о разбавлении образца водноспиртовой смесью.

Критерии оценки качества спиртных напитков по составу летучих компонентов.

Развитие нежелательных процессов, отрицательно влияющих на органолептические свойства, оценивали по содержанию следующих компонентов:

1. Процессы скисания виноматериала выявляли по повышенному содержанию уксусной кислоты (выше 700 мг/л и сопутствующих ей этиловых эфиров, прежде всего этилацетата (порок вин и коньяков «штих»).

2. Преобладание яблочно-молочного брожения над спиртовым оценивали по содержанию этиллактата (в качественных коньяках 50-200 мг/л).

3. Окислительные процессы контролировали по содержанию в пробах промежуточных продуктов метаболизма дрожжей – диацетила и ацетоина. С уровня концентраций 15-20 мг/л присутствие этих веществ сопровождается появлением в аромате ацетоновых тонов.

4. Качество виноматериала оценивали по содержанию втор-бутанола. Наличие втор-бутанола в коньячных спиртах и коньяках (более 15 мг/л) обычно связывают с микробиальной порчей сырья (виноматериала). 5. Наличие в коньяке цис-3-гексенола в содержании более 10 мг/приводит к появлению травянистых тонов в аромате и вкусе, наличие аллилового спирта в концентрации выше 3 мг/л вызывает горечь и жгучесть.

6. Разбавление коньячного спирта водноспиртовой смесью мы выявляли по пропорциональному снижению (против контрольных или типичных значений) концентраций высших спиртов как наиболее устойчивых к окислительным и этерифицирующим процессам.

7. Выявление ароматизаторов мы проводили по наличию 1,2-пропиленгликоля и бензилового спирта, глицерина, триацетина.

Методика определения состава компонентов древесины дуба в коньяках и коньячных спиртах методом хромато-масс-спектрометрии.

Разделение проводили на капиллярной колонке НР-5MS длиной 30 м, внутр. диаметром 0,25 мм, толщина пленки НФ 0,25 мкм. Температурная программа: 70 (1мин), 10°C/мин, 280°C (15мин). Количественный анализ проводили по выбранным ионам: m/z 152, 151, 178, 181, 182, 99, 164, 88,73. 213 и 59. В качестве внутреннего стандарта использовали о-ванилин концентрацией 2 мг/л.

Подготовка пробы для анализа.

В виалу вместимостью 2 мл вносили 1660 мкл образца, 50 мкл внутреннего стандарта и 280 мкл бутилацетата. Экстракцию проводили в виале, анализировали верхний органический слой.

Критерии оценки качества коньяков и коньячных спиртов по составу компонентов древесины дуба (маркеров возраста).

Продукты этанолиза древесины дуба (ванилин, сиреневый альдегид и другие) накапливаются в коньячном спирте при его выдержке в определенных типичных соотношениях. Отсутствие в образце каких либо маркеров возраста (или изменение их соотношений) позволяет предположить добавление ароматизатора. Наиболее простой и часто встречающийся случай фальсификации возраста: добавление ванилина в коньячный спирт, при этом сиреневый альдегид и другие компоненты отсутствуют. Анализ образцов коньяка с негативными органолептическими признаками – «можжевеловыми» тонами показал, что эти образцы содержат завышенное (примерно в 150-200 раз против типичного) содержание эвгенола, что свидетельствует об использовании сырой древесины для выдержки. Одним из наиболее значимых признаков подлинность при ГХ-МС анализе являются цис- и транс- ?-метил-?-окталактоны (МО-лактоны) – летучие вещества древесины дуба. Полное отсутствие МО-лактонов отмечали в образцах сделанных на основе ароматизаторов. Завышенные содержания МО-лактонов наблюдали в коньяках изготовленных по «ускоренной» технологии выдержки (см. Рис. 2).

Рис. 2. Фрагменты хроматограмм по выбранным ионам экстракта коньяка и коньячного спирта.

Методы хромато-масс-спектрометрического анализа в химико-токсикологическом исследовании наркотических и сильнодействующих средств [22-50, 67-69]

Предлагаемый нами методический подход [7-9] базируется на сумме двух известных принципов. Принцип первый – трансляция абсолютных фиксированных (по внутреннему стандарту) времен удерживания. В газовой хроматографии метод трансляции фиксированных времен удерживания предложен фирмой Agilent (Hewlett Packard) в середине 90-х годов ХХ века. Перенос фиксированных времен удерживания выполняют для однотипных колонок при одинаковой температурной программе, что позволяет получить относительные и абсолютные фиксированные времена удерживания большого количества соединений с точностью не хуже 1% (+/-0.05 мин). В антидопинговом анализе при замене колонки абсолютные времена удерживания получают без анализа веществ сравнения по времени удерживания внутреннего стандарта, что регламентируется документами ВАДА, при этом погрешность трансляции должна быть не хуже 0.2 мин (WADA Technical Document TD2003IDCR). Обычно трансляцию выполняют таким образом, чтобы абсолютное время удерживания было в пределах «окна» поиска. Принцип второй – эффективный способ обработки масс-спектрометрических данных. «Система автоматической масс-спектрометрической деконволюции и идентификации» (AMDIS, Automated Deconvolution and Identification System), разработанная в институте NIST (США) в середине 90-х годов ХХ века. Методы, базирующиеся на принципе деконволюции ГХ-МС данных, наиболее эффективны и являются основной тенденцией автоматической идентификации. Под деконволюцией понимают интегрированный набор процедур получения чистых спектров индивидуальных соединений при обработке ГХ-МС данных. Опознавание («восприятие») вещества происходит по совпадению максимумов и характера кривизны пиков ионных хроматограмм, экстрагируемых из полного ионного тока. Нами предложен подход, объединяющий методы трансляция времен удерживания и автоматической деконволюции. Для этого были разработаны библиотеки масс-спектров с временами удерживания, что позволило создать унифицированный метод автоматической идентификации с возможностью непрерывного обновления версий и применить его в системе химико-токсикологических лабораторий. Первые результаты, полученные нами в 7 лабораториях, были опубликованы в 2003 г. [59].

Устранение мешающих влияний при автоматической деконволюции-идентификации.

Можно выделить следующие типы мешающих влияний при использовании программы автоматической обработки AMDIS. Это получение чистых спектров целевых соединений в сложных органических матрицах с большим количеством соединений, образующих «сплошной» фон или идентификация минорных веществ, элюирующихся одним пиком с веществами, присутствующими в большой концентрации. Еще одним фактором, приводящим к «пропуску» вещества в пробе было искажение формы пика целевого вещества при перегрузке колонки (метаболиты JWH-018, JWH-250). Также не удается идентифицировать вещества, поздно элюирующиеся из колонки при выбранных температурных режимах хроматографирования (зопиклон, силденафил (виагра) и ее аналоги: варденофил, тадалофил). Перечисленные мешающие влияния устраняли, изменяя условия пробоподготовки и анализа следующим образом. В случае анализа сложных матриц (загнившие ткани, волосы, а также контрольные пробы биообъектов, проступающие в лабораторию при проведении профессионального тестирования, готовили шесть аликвот или навесок пробы 1-А6, которые анализируют (в последовательности с использованием автосамплера) по схеме, приведенной в Табл. 4. Изменяемыми параметрами являются: деление потока при вводе пробы для снятия перегрузки колонки, использование «быстрой» и «плавной» температурных программ, что позволяет определять «тяжелые» вещества. Анализ дериватизованной и недериватизованной пробы позволяет элюировать вещества в области хроматограммы свободной от фона. Анализ гидролизованной и нативной пробы позволяет определять малые содержания конъюгированных и лабильных веществ, соответственно.

Проблемы AMDIS идентификации обычно связаны с хроматографическими наложениями или деградацией определяемых веществ при пробоподготовке. Можно привести следующие примеры хроматографических наложений трудно разделяемые при автоматической деконволюции-идентификации:

1. Кетамин и идентифицированный нами ангидротрамадол (продукт деградации трампадола при кислотном гидролизе). 2

2. Норпромедол и продукт гидролиза диазепама 2-метиламино-5-хлорбензофенона (МБХ).

Таблица 4. Пример изменяемыех условий подготовки пробы и анализа)

*«Плавная» температурная программа: 50°C (0,5мин), 99°C/мин 100°C (1мин), 15°C/мин, 280°C (25мин).
**«Быстрая», температурная программа: 100°C (1мин), 35°C/мин, 300°C (15 мин).

Трансляция фиксированных времен удерживания на колонки с метилфенилсилоксановой фазой.

К настоящему времени трансляция метода выполнена на более чем 50 колонках HP-5MS производства фирмы J&W и на 4-х колонках VF-5MS производства фирмы Varian. Параметры колонок обеих фирм были одинаковы: длина колонок 30 м, внутренний диаметр 0.25 мм, толщина пленки неподвижной фазы 0.25 мкм. Использовали две температурные программы приведенные выше. Настройку шкалы фиксированных времен удерживания осуществляли по времени удерживания внутреннего стандарта – дифениламина. Заданное время удерживания 9.26 и 5.54 мин для «плавной» и «быстрой» программы получали, меняя давление или поток через колонку.

При трансляции метода на колонки HP-5MS воспроизводимость фиксированных времен удерживания была не хуже ±0.05 мин. Попытки транслировать метод на колонки разных производителей оказались менее удачными. Несовпадение фиксированных времен удерживания варьировало от 0.01 для никотина, амфетамина, метамфетамина до 0.8 мин для папаверина и хингамина, и до 1.5 мин для дегидроандростерона. Полученные результаты, как и в случае трансляции фиксированных времен на колонки FFAP, дают основания утверждать, что табличные индексы удерживания можно надежно использовать только в тех случаях, когда они получены на колонке одного производителя в условиях полностью идентичных выбранным для анализа. При этом следует отметить важность и полезность применения табличных индексов удерживания в поисковом режиме при идентификации веществ по масс-спектру.

Контроль правильности измерений.

Перед анализом серии проб анализировали заведомо положительные и отрицательные пробы (QC и BLANK). Между пробами анализировали этилацетат по «быстрой» программе для контроля фона прибора. При анализе проб контролировали интенсивность пика внутреннего стандарта.

Способ выявления неизвестных веществ в сложных органических матрицах биологического происхождения (на примере идентификации нового метаболита кетамина).

Задача работы – выявить новые потенциально активные метаболиты, которые могли отвечать за побочные действие препарата. Нами предложены следующие этапы идентификации неизвестного вещества.

1. Выявление спектров с m/z совпадающими с базовыми ионами основного вещества или его метаболитов и составляющие систему признаков. Для веществ, родственных кетамину, это ионы m/z 237, 223, 221, 209, 207, 195, 180, 166, 153, 152, 138, 131, 115. На этом этапе выявили два новых вещества, которые могут являться потенциальными метаболитами (см. Табл. 5).

2. Первоначально эти вещества были обнаружены в моче всех обследованных хирургических больных, получавших кетамин вместе с другими препаратами при анестезии (см. Рис. 3). Также их обнаружили и в моче крыс, которым вводили кетамин. Исследовали примесный состав кетамина различных фирм-производителей. Показано, что исследуемые вещества не являются примесными компонентами кетамина. Эти вещества также могли быть артефактами – продуктами деградации известных метаболитов или самого кетамина при кислотном гидролизе, щелочной экстракции или анализе. Для проверки этого предположения проводили повторный анализ экстрактов с малым содержанием этих веществ после выдержки экстракта в среде насыщенной водной щелочи в течение 12 ч при 80°C. Анализ проводили при различных температурах инжектора (210-310°C). Показано, что содержание этих веществ при повторном анализе не изменилось.

3. Для выявления молекулярного иона проводили детектирование методом квадрупольной масс-спектрометрии и методом масс-спектрометрии типа «ионная ловушка», где из-за условий ионизации более выражены протонированные молекулярные ионы. Исследуемым веществам были приписаны четные молекулярные массы 208 и 206 а.е.м., которые позволили предположить отсутствие азота в молекуле исследуемых веществ. Анализ с беспламенным азотно-фосфорным детектированием также показал отсутствие атома азота в исследуемых веществах.

4. Функциональные группы у исследуемых веществ выявляли анализом дериватизованных проб. В качестве дериватизующих агентов использовали BSTFA и TFAA. Исследуемые вещества дериватов не образовывали, что позволило идентифицировать их как дезаминоноркетамин и его ненасыщенный аналог дезамино-5,6-дегидроноркетамин. Предпринята попытка встречного синтеза идентифицированных веществ (А.А. Формановский). В результате синтеза был получен изомер эпоксиизомер дезаминоноркетамина с близхким масс-спектром. Как показали исследования, синтез этого соединения сложен из-за наличия активного водорода в положении 2 циклогексанонового кольца, что обусловило крайне необычные способности данных веществ к конъюгированию.

Исследование II стадии метаболизма (коньюгации) новых метаболитов кетамина.

В предположении, что дезаминоноркетамин («1») и 5,6-дегидродезаминоноркетамин («2») могут быть артефактами (см. Рис. 3, 4), формирующимися при кислотном гидролизе, провели анализ свободных и гидролизованных фракций мочи хирургических больных и крыс, получавших кетамин. При кислотном гидролизе (5М HCl 90°C 45 мин) отмечали резкое увеличение (на 1.5-2 порядка величины) концентрации обоих веществ, что и могло свидетельствовать об их артефактном образовании при кислотном гидролизе. Для проверки этого предположения те же пробы анализировали после ферментного гидролиза (Helix Pomatia, Sigma HP-2, рН 5,5 37°C, 24ч). При этом были получены сравнимые с предыдущим опытом результаты – также наблюдали резкое увеличение концентрации веществ «1» и «2». Ранее было показано, что эти вещества не содержат функциональных групп и, соответственно, не образуют производных, в том числе и коньюгатов с глюкуроновой и другими кислотами. Однако факт увеличения концентрации обоих веществ после ферментативного гидролиза говорит именно об образовании коньюгатов, причем фермент Helix Pomatia наиболее селективно разрушает О-гликозидную связь глюкуроконьюгатов. Нами предложено следующее объяснение этого наблюдаемого в эксперименте факта. Известно, что благодаря наличию подвижного атома водорода в положении 2 циклогексанонового кольца у веществ «1» и «2» (после потери аминогруппы на I стадии метаболизма) они являются таутомерами, способны образовывать енольную форму и, соответственно, коньюгировать с образованием О-глюкуронидов. При разрушении глюкуронида вещества «1» и «2» переходят в кето- форму, которая и фиксируется при анализе. Известно, что свободные енольные формы таутомеров не определяются хроматографическим анализом. Сам кетамин и его основные метаболиты норкетамин и 5,6-дегидроноркетамин выделяются с мочой преимущественно в неконьюгированном виде (см. Табл.5).

Таблица 5. Масс-спектры и фиксированные времена удерживания кетамина, его метаболитов и примесных веществ

Рис. 3. Хроматограммы по полному ионному току мочи хирургического больного, получавшего кетамин и другие препараты внутривенного наркоза. 12, 13 – новый метаболит кетамина и его ненасыщенный аналог

Рис. 4. Хроматограммы по полному ионному мочи крыс, получавших кетамин (30 мг/кг). 12, 13 – новый метаболит кетамина и его ненасыщенный аналог.

Трамадол, связь между структурой метаболитов и примесных веществ.

Методический подход выявления и идентификации новых метаболитов (описанный выше для идентификации новых метаболитов кетамина) применили для исследования препарата трамадол. В большинстве исследованных нами случаев метаболиты ТРМ в значимом количестве были зарегистрированы только в моче больных получавших ТРМ в дозе 50-100 мг. При этом основным метаболитом был О-деметилтрамадол, содержание которого не превышало 10% от содержания ТРМ определяемого в моче.

Для дифференциации метаболитов и примесных веществ ТРМ определяли состав примесей активного вещества препарата ТРАМАЛ (Grunental, Германия). Было обнаружено примесное вещество с молекулярной массой 261 а.е.м.. Масс-спектр и вероятная структура этого соединения, идентифицированного (по масс-спектру) как эпокситрамадол приведены в Табл. 6. Это вещество обнаруживали в следовых концентрациях и в моче больных, получавших ТРМ. Однако в ряде исследованных случаев мы наблюдали иную картину. В пробах мочи, отобранных через 3 суток после проведения хирургической операции, регистрировали содержание эпокситрамадола сравнимое с содержанием самого ТРМ, что позволяют предположить кумуляцию эпокситрамадола в организме или путь метаболизма, приводящий к образованию метаболита со сходной структурой.

Таблица 6. Масс-спектры трамадола и родственных соединений