Введение

Хронический простатит (ХП) составляет до 35% всех обращений к врачу по поводу урологических проблем среди мужского населения России трудоспособного возраста [4, 12, 13, 19, 21].

Лечение ХП должно быть комплексным и обязательно предусматривать воздействие на все звенья этиологии и патогенеза заболевания. Возрастает интерес к лекарственным средствам из природного сырья, которые проявляют выраженную терапевтическую активность и минимум побочных эффектов по сравнению с синтетическими препаратами [2, 7, 8, 16, 17, 20].

В последнее время рядом исследователей отмечается перспективность применения в терапии ХП таких природных компонентов как желчь медведя и экстракт пчелиного подмора. Медвежья желчь содержит совокупность жирных кислот, среди которых преобладают полиненасыщенные жирные кислоты (линолевая и линоленовая кислоты) и урсодезоксихолиевая кислота; в составе пчелиного подмора доминирует хитозан-меланиновый комплекс, а также присутствуют незаменимые аминокислоты и гепароиды. В комплексе данные компоненты оказывают антиоксидантное, иммуностимулирующее и антибактериальное действие, в целом нормализуя функцию мочеполовой системы [3, 14, 15, 18, 28, 30, 31].

Оптимальной лекарственной формой для лечения заболеваний предстательной железы являются суппозитории, поскольку они обеспечивают высокую скорость всасывания и местное действие, уменьшают побочное действие лекарственных веществ, снижают степень и частоту аллергизирующего действия препаратов. Среди простатопротекторов, представленных на фармацевтическом рынке России, отсутствуют препараты, содержащие в комбинации такие компоненты животного происхождения как желчь медведя и пчелиный подмор, в форме суппозиториев. В связи с этим их разработка является перспективной задачей, которая позволит расширить номенклатуру лекарственных препаратов, используемых в терапии заболеваний предстательной железы [1, 10, 25, 26].

Цель исследования

Цель настоящего исследования – обоснование состава, технологии и оценка качества комбинированных суппозиториев с медвежьей желчью и сухим экстрактом пчелиного подмора.

Материалы и методы исследования

В качестве активных компонентов использованы желчь медведя натуральная кристаллическая производства ООО "Лиатон" (Россия), представляющая собой крупнокристаллический порошок коричневого цвета со специфическим запахом, плохо растворимый в воде, а также сухой экстракт пчелиного подмора, изготовленный ООО "ПК Элсервис" (Россия) – желтоватый неоднородный порошок, нерастворимый в воде. Качество данных биологически активных веществ природного происхождения отвечает требованиям нормативной документации [22, 27, 29], что подтверждается сертификатами соответствия [23, 24] и результатами входного контроля используемого сырья, которое оценивалось по следующим показателям: подлинность, количественное содержание действующих веществ и микробиологическая чистота.

В исследованиях изучена возможность применения липофильных суппозиторных основ Witepsol Н 12 (группа компаний Sasol Germany GmbH, Германия) и Suppocire NA-15 (международный концерн Gattefosse).

Суппозитории готовили методом выливания по общей технологической схеме. При этом учитывали такие факторы как физико-химические свойства активных компонентов и вспомогательных веществ, полученные коэффициенты замещения и объем ячеек суппозиторной формы.

Оценку качества приготовленных суппозиториев проводили в соответствии с существующей нормативной документацией. С этой целью осуществляли исследование физико-химических и структурно-механических показателей суппозиториев, содержащих медвежью желчь и пчелиный подмор [5, 6].

Для суппозиториев, изготовленных на обеих основах, проводили качественное и количественное определение действующих веществ, определяли отклонение от средней массы, время полной деформации, распадаемость, температуру плавления, растворение, значение рН водного извлечения, а также размер частиц действующих компонентов.

Подлинность и количественное определение действующих компонентов суппозиториев проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с масс-спектрометрическим детектированием. Масс-спектры высокого разрешения получали с использованием гибридного масс-спектрометра с орбитальной ионной ловушкой QExactive ("Thermo Scientific", Германия), с источником ионизации IonMax HESI-II, соединенном с высокоэффективным жидкостным хроматографом Ultimate 3000, оснащенном автосамплером Dionex Ultimate 3000 RS Autosampler, градиентным насосом Dionex Ultimate 3000 RS Pump, дегазатором и блоком для термостатирования хроматографической колонки.

В качестве неподвижной фазы использовали колонку HYPERSIL Gold aQ длиной 150 мм и внутренним диаметром 2,1 мм, размер сорбента 3 мкм ("Thermo Scientific", Германия). В качестве подвижной фазы использовали 0,1% раствор муравьиной кислоты в смеси ацетонитрил:вода в соотношении 5:95 (об.) (А) и 0,1% раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле (Б). Скорость потока подвижной фазы была постоянной и составляла 0,5 мл×мин^-1. Состав элюата изменялся в соответствии с градиентом: 0.00 мин – 5% Б; 2.00-14.00 мин – 5-95% Б; 14.00-18.00 мин – 95% Б; 18.00-18.50 мин – 95-5% Б; 18.50-20.00 мин – 5% Б. Время анализа с учетом стабилизации системы перед вводом следующего образца составляло 23 мин. Для воспроизводимости времен удерживания использовали термостатирование колонки (30 ⁰С). Объем вводимой пробы – 3 мкл. Масс-спектрометрическое детектирование проводили в условиях ионизации электрораспылением в режиме регистрации положительных и отрицательных ионов. Напряжение на капилляре 4,0 кВ; температура капилляра 270 ⁰С; скорость потока распыляющего газа (азот) 0,4 л×мин^-1; скорость потока вспомогательного газа (азот) 0,1 л×мин^-1. Измерения выполняли в диапазоне 100-2000 m/z. Обработку данных проводили с применением программного обеспечения Xcalibur 2.2 ("Thermo Finnigan", США).

Среднюю массу суппозиториев измеряли путем взвешивания на аналитических весах "Mettler Toledo XP 205" (Швейцария); отклонение от средней массы рассчитывали с использованием программы MS Excel.

Определение времени полной деформации (пенетрационный тест) проводили на тестере проницаемости "ERWEKA PM 30" (Германия), а температуры плавления – на приборе "ПТП" с электрическим обогревом (Россия).

Оценку распадаемости суппозиториев осуществляли на тестере распадаемости "ERWEKA ST-32" (Германия). Значение рН водного извлечения из суппозиториев определяли, используя универсальный рН-метр "Piccolo HI 9126" (Германия).

Фракционный состав исходных субстанций, а также измельченных с ПАВ и введенных в суппозитории, изучали с помощью оптического микроскопа марки "МБУ – 4А" (Россия) и окулярного микрометра при общем увеличении 120 (15×8). Для биофармацевтической оценки суппозиториев с медвежьей желчью и сухим экстрактом пчелиного подмора использовали тест "Растворение" в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи XIII издания. Анализ проводили методом "Проточная ячейка" с использованием тестера растворимости "ERWEKA DT 820" (Германия). В качестве среды растворения применяли фосфатный буфер с рН=7,4 и температурой (37±1) ⁰С в объеме 500 мл. Пробы отбирали с помощью коллектора фракций через определенные промежутки времени и проводили количественное определение урсодезоксихолевой кислоты и суммы аминокислот (с пересчетом на глутаминовую кислоту) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с масс-спектрометрическим детектированием. Продолжительность эксперимента составила 45 мин. Статистическую обработку полученных данных проводили с вычислением средних значений, их ошибок, доверительных интервалов среднего результата (с доверительной вероятностью 0,95). Для оценки различий между средними значениями использовали критерий Стьюдента. Величину Т-критерия рассчитывали для равночисленных выборок с несущественно различающейся дисперсией. Обработку данных проводили с применением программного обеспечения MS Excel.

Результаты и их обсуждение

При разработке технологии приготовления суппозиториев особое внимание уделяли фармацевтическим факторам, влияющим на их терапевтическую эффективность, а именно природе суппозиторной основы и вспомогательных веществ, их количеству, а также физико-химическим свойствам медвежьей желчи и экстракта пчелиного подмора. Введение активных компонентов в суппозиторную основу является основным этапом технологии ректальных лекарственных форм [9, 11]. Представленные на фармацевтическом рынке монокомпонентные суппозитории с медвежьей желчью "РектаМед" и сухим экстрактом пчелиного подмора "Пчелка" изготовлены на основе масло какао, которая обладает рядом существенных недостатков: быстрое прогоркание, низкая температура плавления, высокая степень микробной контаминации. В собственных исследованиях, учитывая, что действующим началом являются порошкообразные полидисперсные субстанции, предпочтение было отдано полусинтетическим липофильным основам – Witepsol Н 12 и Suppocire NA-15, которые обладают рядом преимуществ по сравнению с маслом какао: наличие триглицеридов с длинной цепью в их составе обеспечивает быстрое отверждение основ и получение суппозиториев с высокой механической прочностью. Использование данного типа основ, в отличие от гидрофильных, обеспечивает более быстрое и полное высвобождение действующих компонентов в организме человека и исключает раздражающее действие на слизистую оболочку кишечника. Кроме того, данные основы позволяют варьировать технологическими характеристиками суппозиториев путем введения в их основу различных поверхностно-активных веществ (ПАВ) и эмульгаторов. Среди ПАВ нами был выбран твин-80, в качестве эмульгатора – эмульгатор Т-2, произведенные компанией "Sigma Aldrich" (США).

Для проведения экспериментов были изготовлены комбинированные суппозитории, содержащие 0,02 г кристаллической медвежьей желчи и 0,2 г сухого экстракта пчелиного подмора. Выбор дозировки действующих веществ базировался на анализе литературных данных о терапевтической эффективности монокомпонентных суппозиториев, выпускаемых фармацевтической промышленностью [3, 18, 23, 24].

В связи с тем, что количество действующих компонентов в составе суппозиториев превышало 5%, нами были проведены предварительные исследования по определению их фактора замещения для обеих основ. В результате испытаний было установлено, что для Suppocire NA-15 и Witepsol Н 12 он составляет 0,95 и 0,78, соответственно.

Поскольку активные субстанции представляли собой неоднородные порошки, состоящие из крупных частиц размером более 100 мкм, их предварительно измельчали в вибрационной криомельнице CryoMill. Рассчитанное количество основы помещали в фарфоровую чашу и расплавляли на водяной бане-термостате при температуре плавления (50 ± 1) ⁰С. Для обеспечения равномерности распределения лекарственных веществ в суппозиторной основе исследовали возможность использования при изготовлении суппозиториев ПАВ – твина-80 и эмульгатора Т-2. Кроме того, целесообразность введения твина-80 обусловлена его пенетрационными свойствами, обеспечивающими проникновение лекарственных компонентов в ткани предстательной железы через крипты и лакуны внутренней поверхности прямой кишки [21]. Измельченные ранее лекарственные вещества растирали в агатовой ступке с твином-80 и/или эмульгатором Т-2 и поочередно добавляли частями к расплавленной полуостывшей основе, тщательно перемешивали. Формы для выливания суппозиториев с объемом гнезда 2,0 смазывали глицерином. Суппозиторную массу разливали в формы, которые помещали в холодильник на 30 минут, затем извлекали из нее суппозитории, упаковывали и помещали в холодильник при температуре (4 ± 2) ⁰С. В результате были изготовлены комбинированные суппозитории массой 2,0 г. Состав полученных суппозиториев представлен в Табл. 1.

Таблица 1. Состав экспериментальных образцов суппозиториев с медвежьей желчью и пчелиным подмором

Качество суппозиториев, изготовленных по разработанным прописям, оценивали в процессе хранения по следующим показателям: подлинность, количественное содержание действующих компонентов, органолептический контроль (внешний вид, однородность, цвет), средняя масса и отклонение от средней массы, температура плавления, время полной деформации, распадаемость, растворение, рН водного извлечения, размер частиц. С этой целью готовые суппозитории упаковывали в контурную ячейковую упаковку, хранили в условиях холодильника при температуре (4±1)̊ С и подвергали контролю через 3, 6, 9, 12 мес.

Полученные суппозитории с медвежьей желчью и пчелиным подмором имели цилиндрическую форму с закругленным концом и гладкой поверхностью; средняя длина составила (3,2 ± 0,2) см, максимальный диаметр 0,8 см. Цвет суппозиториев был от желтого до желто-бурого, что обусловлено наличием медвежьей желчи. Суппозитории составов №№ 1 и 2 получились достаточно хрупкими, легко крошились. Наблюдалась седиментация активных компонентов в основании суппозитория и вследствие этого неравномерность окраски, поэтому дальнейшие исследования суппозиториев составов №№ 1 и 2 не проводились.

Суппозитории составов №№ 3 и 4 на продольном срезе были однородны, не содержали видимых механических включений, воздушных стержней, были твердыми при комнатной температуре. Результаты качественного и количественного анализа представлены в Табл. 2. В условиях ВЭЖХ в качестве маркеров выбраны урсодезоксихолиевая и глутаминовая кислоты. Для разделения и повышения чувствительности детектирования аминокислоты химически модифицировали фенилизотиоцианатом. Результаты ВЭЖХ-анализа свидетельствуют о том, что в исследуемых условиях хроматографирования урсодезоксихолиевая и глутаминовая кислоты с величинами времени удерживания около 7,5 и 5,5 мин. соответственно хорошо отделяются от других компонентов медвежьей желчи и сухого экстракта пчелиного подмора, что позволило рекомендовать данный метод как для целей идентификаци действующих компонентов суппозиториев, так и для целей стандартизации разрабатываемой лекарственной формы.

Таблица 2. Качественный и количественный состав суппозиториев с медвежьей желчью и сухим экстрактом пчелиного подмора

Значимым показателем качества суппозиториев, содержащих нерастворимое ни в основе, ни в воде вещество, является степень его дисперсности. Она влияет на равномерность распределения вещества в суппозиторной массе, точность его дозирования, а также на процесс высвобождения и полноту проявления терапевтического действия лекарственного препарата в целом. Установлено, что измельчение медвежьей желчи и пчелиного подмора с твином-80 и эмульгатором Т-2 позволило значительно уменьшить степень дисперсности веществ по сравнению с первоначальной. Такое сочетание эмульгаторов обеспечивает размер частиц субстанций до 40 мкм, с преобладанием фракции частиц до 10 мкм, что свидетельствует об удовлетворительной степени дисперсности лекарственных веществ.

Результаты оценки качества комбинированных суппозиториев с медвежьей желчью и экстрактом пчелиного подмора составов №№ 3 и 4 представлены в Табл. 3 и на Рис. 1.

Таблица 3. Показатели качества комбинированных суппозиториев с медвежьей желчью и пчелиным подмором

Рисунок 1. Микропрепараты субстанций и поперечного среза суппозиториев (15х8)

Результаты изучения скорости и полноты высвобождения урсодезоксихолиевой кислоты и суммы аминокислот из суппозиториев в зависимости от вида основы по тесту "Растворение" представлены в Табл. 4.

Таблица 4. Результаты высвобождения урсодезоксихолиевой кислоты и суммы аминокислот (в пересчете на глутаминовую кислоту) из суппозиториев (%) в зависимости от вида суппозиторной основы

Как видно из данных, представленных в Табл. 3 и 4 и на Рис. 1, суппозитории, изготовленные на основах Witepsol Н 12 и Suppocire NA-15 с добавлением комплекса ПАВ твина-80 и эмульгатора Т-2, отвечают требованиям Государственной Фармакопеи XII и XIII издания, предъявляемым к ректальным лекарственным формам. Кроме того, в результате изучения стабильности ингредиентов и показателей качества установлено, что разработанные суппозитории стабильны в течение 12 месяцев.

Таким образом, в результате проведенных экспериментальных исследований для лечения хронического простатита предложены суппозитории, содержащие в своем составе в качестве активных компонентов медвежью желчь кристаллическую и сухой экстракт пчелиного подмора. Полученные комбинированные суппозитории позволят расширить ассортимент отечественных лекарственных препаратов, используемых в терапии заболеваний предстательной железы.