Введение

Одним из наиболее распространенных и социально значимых неврологических заболеваний является эпилепсия. По данным ВОЗ, во всем мире от него страдает около 50 млн человек, что составляет 0,5-1% населения. В настоящее время известно большое число основных (вальпроаты, карбамазепин, фенитоин, топирамат, леветирацетам) и дополнительных (ретигабин, перампанел, лакосамид и др.) противоэпилептических средств. Особенностью их применения является необходимость длительной, а нередко пожизненной терапии, в связи с чем к препаратам данной группы предъявляют особые требования в отношении безопасности и влияния на качество жизни пациентов. Наиболее часто назначаемыми антиконвульсантами являются вальпроаты, основными показаниями к применению которых являются эпилепсия различных форм (большие и малые приступы, миоклоническая, тонико-клоническая и биполярная формы), а также эпилептический синдром [7,9]. Препараты вальпроевой кислоты обычно хорошо переносятся пациентами, однако при их использовании возможно развитие ряда серьезных неблагоприятных реакций, среди которых наиболее значимыми являются поражение печени и тератогенность. Кроме того, вальпроаты могут оказывать негативное влияние на ЦНС, в том числе снижать скорость психомоторных реакций и мышления, вызывать повышенную сонливость, поведенческие нарушения, изменение настроения, а при использовании в высоких дозах они обладают нейротоксичностью [8]. Экспериментально показано, что в дозах, близких к миорелаксантным, натрия вальпроат оказывает угнетающее влияние на ориентировочные рефлексы у грызунов [3]. В связи с этим важнейшим этапом доклинических испытаний новых противоэпилептических средств является оценка нейротоксичности и исследование влияния на поведенческие реакции подопытных животных.

Цель исследования

Целью настоящего исследования явилась оценка влияния вальпразоламида – нового противоэпилептического средства из группы амидных производных вальпроевой кислоты на ориентировочно-исследовательское поведение грызунов.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования явился вальпразоламид (N-(5-Этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2-пропилпентанамид), синтезированный в АО "Всероссийский научный центр по изучению безопасности биологически активных веществ" (г. Старая Купавна) проф. С. Я. Скачиловой [5]. По химической структуре вальпразоламид представляет собой амидное производное вальпроевой кислоты и 1,3,4-тиадиазола (рис. 1).

Рис. 1. Химическая структура вальпразоламида (N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2-пропилпентанамид).

Экспериментальные исследования выполнены с использованием белых аутбредных мышей-самцов SHK массой 19-21 г. Животных содержали при постоянной температуре (22±2°C) и искусственном 12-часовом режиме дня и ночи (светлое время 08:00-20:00) со свободным доступом к воде и пище. Условия содержания подопытных животных соответствовали правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ [6]. Все эксперименты осуществляли в соответствии с методическими рекомендациями по проведению доклинических исследований лекарственных средств [4] с соблюдением "Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях" (Directive 2010/63/EU) при наличии разрешения этического комитета Тверского государственного медицинского университета.

Ориентировочно-исследовательское поведение грызунов изучали в тестах "Открытое поле" и "Темная/светлая камера" [2]. Тестирование проводили в светлое время суток (с 9 до 11 часов утра). Вальпразоламид вводили подопытным мышам внутрибрюшинно за 40 мин до тестирования в дозах 75 мг/кг, 150 мг/кг, 300 мг/кг и 450 мг/кг. При выборе доз вальпразоламида учитывали, что значение DL₅₀ (среднесмертельная доза) при внутрибрюшинном введении мышам составляет 923 мг/кг (95% ДИ 837,9 – 1007,3), значение TD₅₀ (среднетоксическая доза, при использовании которой неврологический дефицит в тесте вращающегося стержня отмечается у 50% животных) равно 452 мг/кг (95% ДИ 363,3 – 548,7), а ED₅₀ (среднетерапевтическая доза, при использовании которой противоэпилептический эффект отмечается у 50% животных) и ED₈₄ при пентилентетразоловых судорогах составляет 63,4 мг/кг (95% ДИ 29,6 – 97,2) и 128 мг/кг соответственно. В связи с тем, что вальпразоламид по химической структуре относится к вальпроатам, в качестве препарата сравнения использовали кислоту вальпроевую в дозе 150 мг/кг (ED₅₀ – среднетерапевтическая доза, при использовании которой противоэпилептическая активность в тесте с подкожным введением пентилентетразола проявляется у 50% животных). Животные группы контроля получали изотонический раствор натрия хлорида.

Наблюдение за подопытными грызунами в установке "Открытое поле" (ООО "НПК Открытая наука", Россия) проводили в течение 5 минут с использованием видеокамеры, подвешенной на штатив над установкой. Установка для тестирования представляла собой круглую арену (диаметром 60 см со стенками высотой 30 см), расчерченную на 3 ряда секторов (центр, прецентральные и периферические) с 13 отверстиями (норками) диаметром 1 см в полу площадки. Подопытное животное помещали в один из секторов периферии площадки и позволяли свободно перемещаться в течение 5 минут при отсутствии экспериментатора в помещении. Анализ паттернов поведения проводили при изучении видеозаписи эксперимента. Регистрировали время нахождения в центральных и периферических секторах, число пересечений центральных и периферических секторов, вертикальных стоек, заглядываний в отверстия, болюсов, груминга и мочеиспусканий [1-2,4]. После каждого животного поверхность "открытого поля" тщательно промывали несколько раз и высушивали. Дополнительно оценивали поведение мышей в тесте "Темная/светлая камера". Данный тест основан на естественном стремлении грызунов избегать ярко освещенных мест. Тестирование осуществляли с использованием установки "Темная/светлая камера" (ООО "НПК Открытая наука", Россия). Подопытных животных помещали в светлый отсек установки, регистрировали число перемещений между отсеками и время нахождения в темном и светлом отсеках камеры в течение 3-х минут наблюдения.

Результаты исследований обрабатывали статистически с применением программного обеспечения "AnalystSoft Inc., BioStat – программа статистического анализа. Версия 2009". Анализ вида распределения количественных признаков и проверку равенства дисперсий проводили с использованием критерия Шапиро-Уилка. Для оценки достоверности различий выборок, имеющих нормальное распределение, применяли параметрический t-критерий Стьюдента и однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, в случае ненормального распределения использовали U-тест Манна-Уитни и критерий Краскела-Уоллиса. Для сравнения 2-х относительных показателей, характеризующих частоту определенного признака, использовали точный критерий Фишера. В случаях нормального распределения данные представляли в виде m±SEM (среднее±стандартная ошибка среднего), в случаях ненормального распределения в виде – Me (LQ – UQ) (медиана, 25%-й и 75%-й квартили). За достоверное принимали различие при уровне вероятности 95% и более (p<0,05).

Результаты исследования и их обсуждение

В тесте "Открытое поле" оценивали влияние вальпразоламида на ориентировочно-исследовательскую активность и уровень тревожности мышей в условиях воздействия незначительного стрессового фактора (открытое освещенное пространство, новая обстановка). Основными паттернами, характеризующими ориентировочно-исследовательскую активность грызунов, являются горизонтальная двигательная активность (перемещение по площадке), а также обнюхивание краев и обследование (засовывание головы внутрь отверстий "по глаза") отверстий в полу арены (норковый рефлекс).

Анализ горизонтальной двигательной активности мышей группы контроля показал, что большая часть пересечений секторов (62,4%) приходилась на периферию арены, тогда как в середине (2/3 арены) и в центре арены грызуны совершали соответственно 32,3% и 5,3% пересечений секторов. В сериях опытов с введением вальпроатов большая часть перемещений подопытных животных также приходилась на периферию площадки. Так, было показано, что при однократном внутрибрюшинном введении вальпразоламида в дозах 75 мг/кг, 150 мг/кг и 300 мг/кг на периферии арены грызуны совершали соответственно 70%, 62,2% и 67,5% пересечений секторов, что достоверно не отличалось от уровня горизонтальной активности животных контрольной группы и подопытных мышей, получавших вальпроевую кислоту (150 мг/кг). Одновременно отмечено, что при введении вальпразоламида в дозе 450 мг/кг (TD₅₀ в тесте вращающегося стержня) у подопытных животных отмечалась шаткая, неустойчивая походка, уменьшение общего числа пересеченных секторов в среднем в 2,5 раза (t-критерий Стьюдента, р<0,05) по сравнению с контролем. Большая часть времени (87,9%) и активности (72,8% пересеченных секторов) подопытных животных, получавших вальпразоламид в дозе 450 мг/кг, приходились на периферию площадки (табл. 1).

Таблица 1. Влияние вальпразоламида и вальпроевой кислоты на горизонтальную двигательную активность мышей в тесте "Открытое поле", m±SEM

Разновидностью ориентировочно-исследовательского поведения мышей является "норковый" рефлекс, который свидетельствует о способности животных исследовать открытое поле. Среднее число обследованных отверстий в полу площадки (норок) у мышей группы контроля составило 9,5±1,2. В сериях опытов с введением вальпразоламида (75 мг/кг и 150 мг/кг) и вальпроевой кислоты (150 мг/кг) значение данного показателя достоверно не отличалось от контроля (p<0,05, t-критерий Стьюдента). Одновременно показано, что при введении вальпразоламида в дозе 300 мг/кг исследовательская активность подопытных мышей незначительно повышалась, о чем свидетельствовало увеличение числа обследованных отверстий в среднем в 1,3 раза (p<0,05, t-критерий Стьюдента) по сравнению с контролем, тогда как при введении вальпразоламида в дозе 450 мг/кг исследовательская активность подопытных животных напротив достоверно (p<0,05, t-критерий Стьюдента) угнеталась (в среднем в 2,2 раза) (рис.1).

Полученные данные свидетельствуют о том, что при применении в терапевтических для противосудорожной активности дозах вальпразоламид не изменяет или повышает отдельные проявления исследовательской активности подопытных животных, тогда как в высоких дозах может угнетать ориентировочные рефлексы у грызунов.

Рис.1. Влияние вальпразоламида (75 мг/кг, 150 мг/кг, 300 мг/кг и 450 мг/кг) и вальпроевой кислоты (150 мг/кг) на норковый рефлекс (число обследованных отверстий в полу площадки) у мышей.

Обращает на себя внимание тот факт, что угнетение ориентировочных рефлексов в тесте "Открытого поля" в сериях опытов с вальпразоламидом отмечалось при его введении в дозе, вызывающей неврологический дефицит в тесте вращающегося стержня у 50% животных (450 мг/кг).

Вертикальную двигательную активность грызунов в тесте "Открытого поля" оценивали по числу вертикальных стоек, среди которых выделяли 2 разновидности: Climbing (вертикальные стойки с упором, при которых задние лапы животного остаются на полу арены, а передние упираются в стенку поля) и Rearing (вертикальные стойки без упора, при которых передние лапы остаются на весу). Вертикальные стойки у грызунов являются паттернами, характеризующими их эмоциональную тревожность. Отмечено, что общее число вертикальных стоек в группе контроля составило 25,6±2,3, при этом превалировали стойки с упором (65,6%). Применение вальпразоламида в терапевтических дозах и вальпроевой кислоты не влияло на вертикальную двигательную активность и соответственно на эмоциональную тревожность мышей, так как достоверных изменений общего числа вертикальных стоек и их структуры у подопытных животных, получавших вальпроаты, обнаружено не было. При введении вальпразоламида в дозе 450 мг/кг у подопытных мышей отмечались только стойки с упором, число которых было в среднем в 4,5 раза (p<0,05, t-тест Стьюдента) меньше, чем в контроле, что, вероятно, является проявлением нейротоксичности (табл. 2).

Таблица 2. Влияние вальпразоламида и вальпроевой кислоты на вертикальную двигательную активность у мышей в тесте "Открытое поле", m±SEM

Одним из характерных, стереотипных компонентов поведения грызунов является реакция груминга (чистки шерсти). Эта реакция возникает в ответ на неспецифические раздражители, не связанные с загрязнением животных. Груминг появляется в ситуациях, связанных с действием различных раздражителей или в ситуациях, приводящих к повышению уровня возбуждения животных. Короткий груминг проявляется 1-2 быстрыми круговыми движениями лап вокруг носа и небольшой области около него, а длительный – умыванием области глаз, заведением лап за уши и переходом на умывание всей головы, лап, боков, туловища, аногенитальной области, хвоста. Отмечено, что мыши контрольной группы наиболее часто совершали короткий груминг, однократный длительный груминг отмечался у 83% подопытных животных контрольной группы. В сериях опытов с введением вальпразоламида в дозах 75 мг/кг, 150 мг/кг и 300 мг/кг достоверных изменений частоты короткого и длительного груминга у подопытных мышей обнаружено не было, тогда как при введении вальпразоламида в дозе 450 мг/кг и вальпроевой кислоты в дозе 150 мг/кг отмечалось достоверное уменьшение актов короткого груминга соответственно в 2 раза и 3 раза (p<0,05, U-тест Манна-Уитни) по сравнению с контролем. В серии опытов с введением вальпроевой кислоты уменьшение числа короткого груминга компенсировалась увеличением длительного (p<0,05, U-тест Манна-Уитни) (табл. 3).

Таблица 3. Влияние вальпразоламида и вальпроевой кислоты на частоту груминга и дефекации у мышей в тесте "Открытое поле", Me (LQ – UQ)

Полученные данные подтверждают тот факт, что вальпразоламид в дозе 450 мг/кг (TD₅₀ в тесте вращающегося стержня) оказывает угнетающее влияние на ЦНС. При использовании в терапевтических для противоэпилептической активности дозах новое производное вальпроевой кислоты не оказывает достоверного влияния на частоту груминга и дефекации у грызунов в условиях воздействия на них стрессового фактора в виде открытого освещенного пространства в тесте "Открытого поля".

Влияние вальпразоламида на ориентировочно-исследовательское поведение грызунов оценивали также с использованием установки "Тёмная/светлая камера", состоящей из "безопасного" тёмного и ярко освещённого светлого отсеков с отверстием для перехода из одного отсека в другой. Тест "Темная/светлая камера" основан на врождённом избегании грызунами ярко освещённых мест (норковый рефлекс) и на спонтанном ориентировочно-исследовательском поведении животных. Модель создает конфликтную ситуацию для мыши, которая склонна исследовать незнакомую область, однако, первоначально хочет избежать неизвестного (неофобия). Конфликт создается между естественным ориентировочно-исследовательским поведением и реакцией избегания неизвестного. Установку используют для оценки тревожного поведения грызунов. Интервал времени, проведенного в тёмном отсеке, коррелирует с уровнем тревожности, тогда как число выходов и время обследования освещённого отсека – показатели склонности к риску и исследовательской активности. При низком уровне тревоги увеличивается число переходов между темным и светлым отсеками камеры.

Анализ результатов проведенного исследования показал, что однократное внутрибрюшинное введение вальпразоламида в дозах 75 мг/кг, 150 мг/кг и 300 мг/кг не влияло на уровень тревожности и ориентировочно-исследовательское поведение мышей в тесте "Темная/светлая камера". Об этом свидетельствовало отсутствие достоверных изменений в числе переходов между камерами и времени нахождения грызунов в светлой камере в сериях опытов с введением вальпразоламида в различных дозах (критерий Краскела-Уоллиса, р=0,306). При однократном внутрибрюшинном введении вальпразоламида в дозе 450 мг/кг отмечено достоверное уменьшение времени нахождения подопытных животных в светлой камере и уменьшение числа переходов из камеры в камеру по сравнению с контролем (p<0,05, U-тест Манна-Уитни). (таб.4).

Таблица 4. Число переходов из камеры в камеру и время нахождения мышей в светлой камере (при внутрибрюшинном введении вальпразоламида и вальпроевой кислоты в тесте "Темная/светлая камера", Me (LQ – UQ)

Полученные данные подтверждают сведения о том, что в высоких дозах вальпразоламид так же, как и другие противоэпилептические средства из группы производных вальпроевой кислоты может вызывать угнетение центральной нервной системы.

Выводы

Новое противоэпилептическое средство вальпразоламид при использовании в дозах 75 мг/кг и 150 мг/кг (терапевтические дозы при пентилентетразоловых судорогах) не оказывал достоверного влияния на ориентировочно-исследовательское поведение мышей в тестах "Открытое поле" и "Темная/светлая камера". При однократном внутрибрюшинном введении в дозе 300 мг/кг (терапевтическая доза при судорогах, индуцированных максимальным электрошоком) повышал отдельные проявления исследовательской активности грызунов (горизонтальную двигательную активность при тестировании в открытом поле). Незначительное усиление исследовательской активности подопытных мышей отмечалось также при введении вальпроевой кислоты в дозе, равной ED₅₀ при пентилентетразоловых судорогах (150 мг/кг). Угнетающее влияние на ориентировочные рефлексы у грызунов вальпразоламид оказывал при использовании в дозе, близкой к значению TD₅₀, вызывающей неврологический дефицит в тесте вращающегося стержня у 50% животных (450 мг/кг).