Введение

Моделирование взаимодействия с организмом с целью проведения скрининга с использованием молекулярного докинга и полученных на его основе соотношений "структура-активность", позволяет проводить целенаправленный поиск соединений с выбранным видом фармакологической активности. Использование молекулярного докинга возможно в том случае если известна мишень, с которой взаимодействует исследуемый лиганд. Перед проведением скрининга методом молекулярного докинга важно узнать фермент, воздействие на который, приводит к появлению у исследуемого лиганда анализируемой биологической активности.

Антраниловая кислота принимает участие в широком спектре биохимических реакций, используется в качестве одного из ключевых реагентов в полусинтетическом методе получения ряда антибиотиков, как например, кальцимицина, проявляющего противомикробную активность [16]. Производные антраниловой кислоты, а именно амиды и гидразиды, относятся к классу биологически активных соединений, обладающих широким спектром фармакологической активности: противомикробной [10,13,17], противовоспалительной [8,15] и анальгетической [11].

Проведение моделирования по противомикробной активности является актуальным при проведении целенаправленного поиска веществ с выраженной противомикробной активностью [12,18]. Сочетание молекулярного докинга с физико-химическими дескрипторами, позволяет учитывать в проводимых исследованиях физико-химические свойства веществ, увеличивая качество модели, как например, модель "структура-противовоспалительная активность" [2].

Цель работы заключается в исследовании связи "структура-активность" с использованием молекулярного докинга по ферменту гидролаза E.Coli (S.Aureus) в ряду замещенных амидов и гидразидов N-ароилантраниловых кислот (20 соединений).

X=Br, Y=H, R₁ = H, R₂ = NH₂ (1); X=Br, Y=H, R₁ = CO 2–COOHC₆Cl₄, R₂ = NH₂ (2); X=Br, Y=H, R₁ = CO 3–NO₂ C₆H₄, R₂ = NH₂ (3); X=Br, Y=H, R₁ = CO 4–CH₃ C₆H₄, R₂ = NH₂ (4); X=Cl, Y=H, R₁ = CO 4–Cl C₆H₄, R₂ = NH CH₂C₆H₅ (5); X=Br, Y=H, R₁ = CO C₆H₅, R₂ = NH C₆H₅ (6); X=Br, Y=H, R₁ = CO 2-фурил, R₂ = NH NHCO(2-фурил) (7); X=Br, Y=H, R₁ = CO C₆H₅, R₂ = NH CH₂CH₂OH (8); X=Br, Y=H, R₁ = CO 4–Cl C₆H₄, R₂ = NH₂ (9); X=Cl, Y=H, R₁ = CO 4–Cl C₆H₄, R₂ = NH 2–CH₃ C₆H₄ (10); X=Br, Y=H, R₁ = CO 4–NO₂ C₆H₄, R₂ = NH C₆H₅ (11); X=Br, Y=H, R₁ = CO 2-фурил, R₂ = NH NHCOCH₂Cl (12); X=Br, Y=H, R₁ = CO C₆H₅, R₂ = NH₂ (13); X=Br, Y=H, R₁ = CO 2–OCH₃ C₆H₄, R₂ = NH₂ (14); X=Br, Y=H, R₁ = CO 4–NO₂ C₆H₄, R₂ = NH CH₃ (15); X=Br, Y=H, R₁ = CO 4–NO₂ C₆H₄, R₂ = морфолил (16); X=I, Y=H, R₁ = CO 4–CH₃ C₆H₄, R₂ = морфолил (17); X=I, Y=H, R₁ = CO C₆H₅, R₂ = NH NHCO-2-фурил (18); X=I, Y=H, R₁ = CO C₆H₅, R₂ = NH NH COCH₂CH(CH₃)₂ (19); X=Br, Y=Br, R₁ = CO C₆H₅, R₂ = NH С₆H₁₁ (циклогексил) (20).

Материал и методы исследования

Оптимизацию структуры и расчёт квантово-химических дескрипторов исследуемых замещенных амидов и гидразидов N-ароилантраниловых кислот проводили с использованием программы Gaussian 03 полуэмпирическим методом РМ3, с полной оптимизации геометрии молекул.

Бактериостатическую активность по отношению к штаммам S.Aureus ATCC 6538-P и E.Coli ATCC 25922 определяли методом двухкратных серийных разведений в жидкой питательной среде [7]. В качестве растворителя соединений использовали диметилсульфоксид. Посевы производили в мясопептонный бульон (pH 7,0) с различной концентрацией испытуемых соединений. Микробная нагрузка составила 250 000 микробных тел на 1 мл.

Моделирование лиганд-рецепторных взаимодействий осуществляли программой AutoDock 4.0 в составе программного комплекса MGL Tools 1.5.6, с использованием Ламарковского генетического алгоритма, который позволяет воспроизводить строение комплексов более точно [14]. При проведении молекулярного докинга использовали трёхмерные модели молекул фермента пептид деформилаза (гидролаза) E.Coli и S.Aureus, информация о которых получена из базы данных RCSB Protein Data Bank: гидролаза E.Coli (PDB ID code: 1LRU [9]) и гидролаза S.Aureus (PDB ID code: 1Q1Y [20]). Изначально, все молекулы воды были удалены из структуры белка. Файлы рецептора и лигандов были конвертированы в формат PDBQT-файла, с добавлением недостающих атомов водорода и частичных атомных зарядов по методу Гастейгера.

Результаты

Структуры всех лигандов были построены и оптимизированы с использованием программы Gaussian 03 полуэмпирическим методом РМ3 с полной оптимизацией геометрии молекул, и затем были конвертированы в 3D-формат (.pdb) с помощью программы ChemBio3D Ultra 12,0.

В результате проведенных квантово-химических расчётов программой Gaussian 03, получены квантово-химические дескрипторы: суммарные значения напряженности электрического поля Σ(Е), потенциала Σ(φ) и заряда в модуле Σ (|q|) на атомах углерода, кислорода, азота и водорода для всей молекулы. С использованием полученных квантово-химических дескрипторов: суммарная напряженность на атомах углерода (C(E)) и азота (N(E)), суммарный потенциал по атомам углерода (C(φ)), кислорода (O(φ)) и азота (N(φ)), и суммарный заряд в модуле по атому кислорода (O(|q|)), провели теоретический расчёт физико-химических дескрипторов исследуемых соединений: констант липофильности (log P_рассч) [3], констант кислотности (pKa_рассч) [1] и основности (pKв_рассч) [1] (таблица 1).

Значения констант липофильности лежат в интервале от 2,12 у соединения 1 до 3,90 (соединение 14). Константы кислотности, характеризующие ионизацию, рассчитанные значения которых находятся в пределах от 6,49 (соединение 2) до 9,58, для соединения 16. Константы основности, находятся в пределах от 11,82 у соединения 16 до 13,16, для соединения 5.

Таблица 1. Квантово-химические дескрипторы, log P_рассч, pKa_рассч и pKв_рассч замещенных амидов и гидразидов N-ароилантраниловых кислот

Для 20 соединений из ряда замещенных амидов и гидразидов N-ароилантраниловых кислот, была экспериментально определена противомикробная активность (ПМА_эксп.) в отношении E.Coli и S.Aureus (таблицы 2 и 3).

Бактериостатическую активность по отношению к штаммам S.Aureus ATCC 6538-P и E.Coli ATCC 25922 определяли методом двухкратных серийных разведений в жидкой питательной среде [7]. В качестве растворителя соединений использовали диметилсульфоксид. Посевы производили в мясопептонный бульон (pH 7,0) с различной концентрацией испытуемых соединений. Микробная нагрузка составила 250 000 микробных тел на 1 мл.

Через 18-20 ч выдержки контрольных пробирок в термостате при температуре 37⁰ С фиксировали результат. Для всех исследуемых 20 соединений определяли минимальные подавляющие концентрации (МПК) (таблицы 2 и 3) [4,5,6].

Установлено, что большинство изучаемых амидов обладает слабой бактериостатической активностью (таблицы 2 и 3), только соединение 2, по структуре амид тетрахлорфталил 5-бромантраниловой кислоты, проявило бактериостатическую активность равную 15,6 мкг/мл, в отношении обоих штаммов. Перед проведением множественного линейного регрессионного анализа, с целью получения равномерной выборки наблюдаемых значений, результат по противомикробной активности МПК (мкг/мл) переводили в логарифм: log (1/МПК), который затем использовали при составлении уравнений и дальнейшей валидации полученных моделей.

Моделирование лиганд-рецепторных взаимодействий осуществляли программой AutoDock 4.0 в составе программного комплекса MGL Tools 1.5.6, с использованием Ламарковского генетического алгоритма, который позволяет воспроизводить строение комплексов более точно [14]. При проведении молекулярного докинга мы использовали трёхмерные модели молекул фермента пептид деформилаза (гидролаза) E.Coli и S.Aureus, информация о которых получена из базы данных RCSB Protein Data Bank: гидролаза E.Coli (PDB ID code: 1LRU [9]) и гидролаза S.Aureus (PDB ID code: 1Q1Y [20]). Изначально, все молекулы воды были удалены из структуры белка. Файлы рецептора и лигандов были конвертированы в формат PDBQT-файла, с добавлением недостающих атомов водорода и частичных атомных зарядов по методу Гастейгера.

В процедуре докинга с координатами точек (60×60×60) вокруг каждого моделируемого участка, по ферменту гидролаза E.Coli при построении Grid-карт за центр были взяты координаты лиганда (x = –35,18, y = 28,54, z = 64,81), а для фермента гидролаза S.Aureus координаты лиганда (x = –18,26, y = 141,93, z = 49,21). В результате получено 20 Grid-карт по параметрам для исследуемых соединений. Оценку качества позиционирования характеризовали величиной RMSD, представляющей собой среднеквадратичное отклонение положения лиганда после докинга от его начального положения.

В качестве активного сайта фермента гидролаза E.Coli был принят участок макромолекулы, содержащий аминокислоты (GLU133, LEU91, LEU125, GLY89, GLU87, ILE44) [9] и для фермента гидролаза S.Aureus, содержащий аминокислоты (GLU155, VAL151, VAL59, GLN65) [20]. Отбор значимых конформаций осуществляли по минимальному значению среднеквадратичного отклонения ∆RMSD от молекулы антибиотика актинонина, использованного в качестве исходной молекулы при построении структур.

Результат проведенного молекулярного докинга по ферментам гидролаза E.Coli и S.Aureus представлен в таблицах 2 и 3 в виде скоринговых функций: энергия связывания (Binding energy (Be_E.Coli и Be_S.Aureus)), межмолекулярная энергия (Intermolecular energy (Ime_E.Coli и Ime_S.Aureus)) и константа ингибирования (Ki_E.Coli и Ki_S.Aureus), характеризующие взаимодействие лиганда с рецептором (гидролаза E.Coli и S.Aureus).

Для соединения 2 с ПМА равной 15,6 мкг/мл приведены диаграммы взаимодействия с гидролазой E.Coli (рисунок 1) и S.Aureus (рисунок 2), включающие водородные связи и гидрофобные взаимодействия по аминокислотам.

Таблица 2. Скоринговые функции и МПК_{(E.Coli)эксп.}, log(1/МПК)_{(E.Coli)эксп.} замещенных амидов и гидразидов N-ароилантраниловых кислот (20 соединений)

Таблица 3. Скоринговые функции и МПК_{(S.Aureus)эксп.}, log(1/МПК)_{(S.Aureus)эксп.} замещенных амидов и гидразидов N-ароилантраниловых кислот (20 соединений)

По атому брома и бензольному кольцу антраниловой кислоты происходит гидрофобное взаимодействие соединения 2 с активным участком фермента – гидролазы E.Coli (рисунок 1) содержащим аминокислоты изолейцин (ILE44) и лейцин (LEU125). Также образуется межмолекулярная водородная связь с аминокислотой аргинин (ARG97) по карбоксилат иону карбоксильной группы заместителя в NH-ацильном фрагменте.

Соединение 2 взаимодействует с гидролазой S.Aureus гидрофобными фрагментами: ароматическим кольцом ядра антраниловой кислоты, атомом брома и атомами хлора в NH-ацильном фрагменте, водородные связи при этом не образуются. Заместитель при NH-ацильной группе, содержащий атомы хлора, вступает в гидрофобное взаимодействие с аминокислотами активного участка гидролазы S.Aureus – валин (VAL59 и VAL151).

Рис. 1. Комплекс соединения 2 с активным участком гидролазы E.Coli. Изображение получено с использованием программы LigandScout.

Рис. 2. Комплекс соединения 2 с активным участком гидролазы S.Aureus. Изображение получено с использованием программы LigandScout.

Обсуждение результатов

С целью составления модели "структура-активность", проведен множественный линейный регрессионный анализ с использованием программы Statistica 6, зависимости log(1/МПК)E.Coli и log(1/МПК)S.Aureus от констант липофильности (logP_рассч), ионизации (pKa_рассч и pKв_рассч) и скоринговых функций по ферментам гидролаза E.Coli (Be_E.Coli, Ime_E.Coli, Ki_E.Coli) и S.Aureus (Be_S.Aureus, Ime_S.Aureus, Ki_S.Aureus).

Всего было сгенерировано свыше 43 уравнений регрессии, из которых методом пошагового включения параметров с использованием программы Statistica 6, были отобраны 4 уравнения (таблица 4) зависимости экспериментально определенной ПМА (log(1/МПК)E.Coli и log(1/МПК)S.Aureus) от logP_рассч, pKa_рассч, Be_E.Coli, Ime_E.Coli, Ki_E.Coli, Be_S.Aureus, Ime_S.Aureus, Ki_S.Aureus.

Установлено, что полученные уравнения имеют наибольшие значения коэффициента корреляции (R), критерия Фишера (F) и критерия оценки методом перекрестного контроля исключением по одному (Q²_LOO), и минимальное значение среднеквадратичной ошибки (S) (таблица 4).

Таблица 4. Уравнения множественной регрессии зависимости log(1/МПК)E.Coli и log(1/МПК)S.Aureus от logP_рассч, pKa_рассч, Be_E.Coli, Ime_E.Coli, Ki_E.Coli, Be_S.Aureus, Ime_S.Aureus, Ki_S.Aureus.

Проведена оценка составленных уравнений методом перекрестного контроля с выбором по одному (Leave-one-out cross-validation, LOO) (Q²_LOO), с использованием программы Statographics. Определен коэффициент детерминации предсказаний Q²_LOO, показывающий значимость составленных уравнений. По результатам проверки можно сделать вывод, что все составленные предсказательные модели на основе уравнений 1-4 являются значимыми, так как значение Q² по LOO для надежных предсказательных моделей должно быть не менее 0,5 [19]. К наиболее значимым по рассчитанным критериям R, F, Q²_LOO относятся модели в виде уравнений №2 и №4.

Полученные уравнения апробированы для теоретического расчёта МПК E.Coli и S.Aureus на примере 4 соединений (21 – 24) из ряда замещенных амидов и гидразидов N-ароилантраниловых кислот (4 соединения).

X=Br, Y=H, R₁ = CO 2–COOH C₆H₄, R₂ = NH C₆H₅ (21); X=Br, Y=H, R₁ = CO 4–Cl C₆H₄, R₂ = NH C₆H₅ (22); X=Br, Y=H, R₁ = CO 2–COOHC₆H₄, R₂ = NH₂ (23); X=Br, Y=H, R₁ = CO 2-фурил, R₂ = NH₂ (24).

Вначале были проведены расчёты физико-химических дескрипторов (logP_рассч и pKa_рассч) и скоринговых функций (таблица 5) по ферментам гидролаза E.Coli (Be_E.Coli, Ime_E.Coli, Ki_E.Coli) и S.Aureus (Be_S.Aureus, Ime_S.Aureus, Ki_S.Aureus) методом молекулярного докинга программой AutoDock 4.0, и на их основе было рассчитано МПК_{рассч. (E.Coli)} (таблица 6) и МПК_{рассч. (S.Aureus)} (таблица 7). Затем была проведена проверка полученных результатов расчётов на экспериментальных данных, были определены МПК_{эксп. (E.Coli)} и МПК_{эксп. (S.Aureus)}.

Таблица 5. Скоринговые функции рассчитанные программой AutoDock 4.0 по E.Coli и S.Aureus, logP_рассч, pKa_рассч замещенных амидов и гидразидов N-ароилантраниловых кислот (4 соединения)

Таблица 6. log(1/МПК)E.Coli рассч., МПКрассч. (E.Coli), log(1/МПК)E.Coli эксп., МПКэксп. (E.Coli) замещенных амидов и гидразидов N-ароилантраниловых кислот (4 соединения)

Таблица 7. log(1/МПК)S.Aureus_рассч., МПК_{рассч. (S.Aureus)}, log(1/МПК)S.Aureus _эксп., МПК_{эксп. (S.Aureus)} замещенных амидов и гидразидов N-ароилантраниловых кислот (4 соединения)

Результаты прогнозируемых значений МПК_{рассч. (E.Coli)} и МПК_{рассч.(S.Aureus)} и экспериментально найденных оказались близки (таблицы 6 и 7).

Расчет прогнозируемой ПМА (МПК_{рассч.(E.Coli)}, МПК_{рассч.(S.Aureus)}, мкг/мл) для 4 соединений, показал, что экспериментально синтезировать целесообразно соединение 24, прогноз ПМА по уравнениям 1-4 составляет: МПК_{рассч. (E.Coli)} (1) = 27 мкг/мл; МПК_{рассч.(E.Coli)} (2) = 51 мкг/мл; МПК_{рассч. (S.Aureus)} (3) = 38 мкг/мл; МПК_{рассч. (S.Aureus)} (4) = 14 мкг/мл.

Полученный результат прогноза ПМА подтверждается экспериментальным исследованием, в результате которого определено МПК_эксп. соединения 24, которое составляет 31 мкг/мл по E.Coli и 15,6 мкг/мл по S.Aureus (таблицы 6 и 7).

Для оценки качества прогноза ПМА_рассч. (МПК_{рассч. (E.Coli)} (1), МПК_{рассч. (E.Coli)} (2), МПК_{рассч.(S.Aureus)} (3), МПК_{рассч.(S.Aureus)} (4), мкг/мл) составлены линейные уравнения взаимосвязи с экспериментальными значениями ПМА_эксп. (МПК_{эксп.(E.Coli)} и МПК_{эксп.(S.Aureus)}):

Линейные зависимости для уравнений 2 и 4, из четырех составленных, с коэффициентами корреляции (R_прогн. (2)= 0,961 и R_прогн. (4)= 0,911), показывают высокую степень связи ПМА_рассч. c ПМА_эксп..

Выводы

Рассчитаны квантово-химические и физико-химические дескрипторы: константа липофильности (logP_рассч), константа кислотности (pKa_рассч) и основности (pKв_рассч).

Установлено, что большинство из двадцати изученных замещенных амидов и гидразидов N-ароилантраниловых кислот обладает слабой бактериостатической активностью по отношению к E.Coli и S.Aureus (таблицы 2 и 3). Наиболее высокую бактериостатическую активность равную 15,6 мкг/мл, в отношении обоих штаммов, проявляет только соединение 2, по структуре амид тетрахлорфталил 5-бромантраниловой кислоты.

Проведены докинг исследования анализируемых соединений, ряда замещенных амидов и гидразидов N-ароилантраниловых кислот методом молекулярного докинга программой AutoDock 4.0, в составе программного комплекса MGL Tools 1.5.6. При проведении молекулярного докинга использовали трёхмерные модели молекул фермента пептид деформилаза (гидролаза) E.Coli и S.Aureus.

Выполнен множественный линейный регрессионный анализ, составлены 4 уравнения (таблица 4) зависимости экспериментально определенной ПМА (log(1/МПК)E.Coli и log(1/МПК)S.Aureus) от logP_рассч, pKa_рассч, Be_E.Coli, Ime_E.Coli, Ki_E.Coli, Be_S.Aureus, Ime_S.Aureus, Ki_S.Aureus. Проведена оценка составленных уравнений методом перекрестного контроля с выбором по одному (Leave-one-out cross-validation, LOO) (Q²_LOO), с использованием программы Statographics. Определен коэффициент детерминации предсказаний Q²_LOO, показывающий значимость составленных уравнений.

Составленные уравнения апробированы для теоретического расчёта МПК E.Coli и S.Aureus на примере 4 соединений (21-24) из ряда замещенных амидов и гидразидов N-ароилантраниловых кислот.

В результате проведенной проверки линейные зависимости для уравнений №2 и №4, из четырех составленных, с коэффициентами корреляции (R_прогн. (2)= 0,961 и R_прогн. (4)= 0,911), показывают высокую степень связи ПМА_рассч. c ПМА_эксп..

Предложены корреляционные уравнения №2 и №4, для проведения дальнейших исследований структура-противомикробная активность, которые позволяют производить достоверный и экономически выгодный прогноз уровня противомикробной активности, выявляя соединения с высокой ПМА до проведения их синтеза и биологических испытаний.

Таким образом, можно сделать вывод, что получены уравнения регрессии взаимосвязи "структура-активность" с использованием метода молекулярного докинга и рассчитанных физико-химических дескрипторов, для поиска биологически активных соединений с противомикробной активностью в ряду производных антраниловой кислоты.