Введение

В настоящее время в мировой практике организации лабораторной медицины одним из самых значимых трендов является централизация лабораторных исследований. При этом возможно существенное повышение качества оказания медицинской помощи пациентам в соответствии с самими строгими требованиями актуальных международных клинических стандартов [1,2]. К очевидным положительным следствиям централизации лабораторий относятся: интенсификация внедрения в лабораторную практику высокоинформативных технологий, значительно повышающих клиническую значимость анализов и уменьшающих сроки их выполнения [3], экономическая выгода, существенное расширение спектра оказываемых лабораторных услуг, упрощение механизмов внесения корректив в технологии централизованных процессов [1,4].

Вместе с тем при укрупнении централизованного лабораторного подразделения неизбежно возникает ряд проблем, и одна из наиболее важных из них – несоответствие имеющихся условий транспортировки и хранения образцов установленным стандартам и правилам [5]. Связано это несоответствие прежде всего с удаленным расположением подконтрольных территорий, что приводит зачастую к несвоевременной доставке проб и их накапливанию, а в результате – к недостоверным результатам, не отражающим реального клинического состояния пациента. Это согласуется также с утверждением, что около 70% всех лабораторных ошибок при анализе образцов биоматериала приходится именно на преаналитическую стадию [6].

Клинический анализ крови (CBC, complete blood count) является важным тестом для диагностики и мониторинга широчайшего спектра заболеваний – но при условии, что качество в течение всего процесса анализа можно гарантировать. На тему стабильности проб крови для выполнения CBC опубликован целый ряд статей, но приводимые в них результаты зачастую противоречивы и в значительной степени зависят от используемых геманализаторов [7-14].

Материал и методы исследования

В данном исследовании использовались образцы цельной крови от 20 амбулаторных пациентов без известных сопутствующих заболеваний и не получавшие антиагрегантную или антикоагулянтную терапию на момент забора крови.

От каждого донора были собраны в пробирки с K₂EDTA 3 образца объемом по 6 мл (т. е. всего – 60 пробирок), и для каждой из этих пробирок в течение 30 минут после сбора были выполнены 3 исходных (базовых) измерения на гематологическом анализаторе UniCel DxH 800 Coulter Cellular Analysis System (Beckman Coulter Inc., USA, Miami, FL). Инструкции, взятые из руководства по эксплуатации анализатора, строго соблюдались. Исследовались изменения следующих параметров клинического анализа крови (CBC): количество лейкоцитов (WBC), количество эритроцитов (RBC), концентрация гемоглобина (HGB), гематокрит (HCT), средний корпускулярный объем (MCV), среднее количество корпускулярного гемоглобина (MCH), средняя корпускулярная концентрация гемоглобина (MCHC), два показателя ширины распределения эритроцитов – RDW (RDW-CV) и RDW-SD, количество тромбоцитов (PLT), средний объем тромбоцитов (MPV).

Для каждого из этих параметров было рассчитано среднее значение по 9 исходным измерениям; эти средние значения были приняты в качестве исходных (базовых).

После определения исходных значений образцы подлежали хранению: из трех образцов, взятых от каждого из 20 доноров, один хранился при комнатной температуре (25°C), второй – в условиях охлаждения (в холодильнике при 4°C), третий – в условиях нагревания (в термостате при 35°C). Образцы анализировались после 3, 6, 12, 24, 48 и 72 часов хранения – в каждой из этих временных точек для каждого из 20 образцов проводились на гематологическом анализаторе 3 измерения интересующих параметров CBC, после чего пробирки вновь хранились при указанных температурах. По этим 3 измерениям рассчитывалось среднее значение каждого параметра CBC, которое принималось как репрезентативное для данного образца и данных значений времени и температуры хранения.

Различия между образцами оценивались с помощью теста совпадающих пар Уилкоксона, p-значения меньше 0,05 считались статистически значимыми. Отклонения от исходного значения в образцах со статистически значимыми различиями затем анализировались с помощью графиков Бланда-Альтмана и сравнивались с текущими спецификациями качества для желательной погрешности (desirable bias), полученной на основе внутрииндивидуальных и межиндивидуальных отклонений [15]. Изменение или сдвиг, превышающие максимально допустимую погрешность, рассматривались как признак неприемлемой погрешности.

Удовлетворительные результаты внутрилабораторного контроля качества в оценке работы геманализатора были получены на протяжении всего исследования. Температура хранения образцов контролировалась и поддерживалась в заданных пределах на протяжении всего эксперимента.

Результаты

В 1-й временной точке, спустя 3 ч. с момента получения исходных значений параметров CBC, проверка статистической значимости различий показателей показала: в охлажденных образцах (4°C) статистически значимых изменений не было, в образцах при комнатной температуре (25°C) – достоверные изменения MCHC и RDW, в нагретых образцах (35°C) – MCHC, RDW и RDW-SD (рис. 1, табл. 1-3).

Рис. 1. (A-K) Сравнение результатов медианных значений между исходным образцом (0 ч.) и различными сроками хранения 3, 6, 12, 24, 48 и 72 ч. при различных режимах хранения: комнатная температура (25°C), нагревание до 35°C и охлаждение до температуры 4°C.

Через 6 ч. в охлажденных образцах статистически значимый сдвиг был зарегистрирован лишь для показателя MPV, в то время как для образцов при комнатной температуре к MCHC и RDW добавился параметр RDW-SD, а для нагретых остались те же изменения, что и ранее – MCHC, RDW и RDW-SD (рис. 1, табл. 1-3).

Через 12 ч. от начала эксперимента в охлажденных образцах была определена достоверная разница значений опять-таки только для MPV, при комнатной температуре набор параметров с изменениями сохранился – MCHC, RDW и RDW-SD, а в образцах из термостата к MCHC, RDW, RDW-SD добавились параметры HCT, MCV и MPV (рис. 1, табл. 1-3).

После 24 ч. хранения при температуре 4°C статистически значимая разница была получена, помимо MPV, и для RDW-SD; при комнатной температуре список из MCHC, RDW и RDW-SD дополнился параметром MCV, а при 35°C – к MCHC, RDW, RDW-SD, HCT, MCV и MPV добавился параметр WBC (рис. 1, табл. 1-3).

Через двое суток (48 ч.) от начала исследования для проб при 4°C к RDW-SD и MPV добавился MCHC, при 25°C список из MCHC, RDW, RDW-SD и MCV стал включать еще и параметры MPV и HCT, при 35°C параметры с изменениями – те же: MCHC, RDW, RDW-SD, HCT, MCV, MPV и WBC (рис. 1, табл. 1-3).

В последней временной точке, 72 ч., в образцах при 4°C достоверно измененные показатели – MPV, RDW-SD, MCHC, MCV и RDW, при 25°C и 35°C те же, что и при хранении 48 ч. (рис. 1, табл. 1-3).

Таблица 1. Медианные значения и статистическая значимость изменений параметров клинического анализа крови при температуре хранения 25°C ((Медиана; межквартильный интервал; 95% доверительный интервал для медианы; p в сравнении с исходным образцом (0 ч))

Таблица 2. Медианные значения и статистическая значимость изменений параметров клинического анализа крови при температуре хранения 4°C (Медиана; межквартильный интервал; 95% доверительный интервал для медианы; p в сравнении с исходным образцом (0 ч))

Таблица 3. Медианные значения и статистическая значимость изменений параметров клинического анализа крови при температуре хранения 35°C (Медиана; межквартильный интервал; 95% доверительный интервал для медианы; p в сравнении с исходным образцом (0 ч))

Следующим этапом исследования являлся анализ графиков Бланда-Альтмана (табл. 4-6) на предмет сравнения выявленных в нашей работе смещений средних значений показателей (bias) с текущими спецификациями качества (desirable quality specifications for bias) [15], указанными в табл. 4-6 как BIASмакс.

Во временных точках 3 ч. и 6 ч. значимые смещения параметров зарегистрированы не были, за исключением MCHC в образцах при 35°C.

Спустя 12 ч. смещение, превышающее текущие спецификации качества, наблюдалось в образцах при комнатной температуре (25°C) для MCHC, а в образцах при 35°C – для HCT, MCV, MCHC и RDW. Через 24 ч. картина для образцов при 35°C не изменилась, а в образцах при комнатной температуре к MCHC добавилось смещение для MCV.

Спустя 48 и 72 ч. смещение выше текущих спецификаций качества было получено в образцах при 25°C для HCT, MCV, MCHC и RDW, при 4°C – для MCHC и PLT, при 35°C – для HCT, MCV, MCHC и RDW.

Таблица 4. Среднее процентное смещение для параметров клинического анализа крови при комнатной температуре хранения (25°C) (в сравнении с исходным образцом (0 ч); % смещения; интервал 95% ДИС для образцов при времени хранения)

Таблица 5. Среднее процентное смещение для параметров клинического анализа крови при температуре хранения 4°C (в сравнении с исходным образцом (0 ч); % смещения; интервал 95% ДИС для образцов при времени хранения)

Таблица 6. Среднее процентное смещение для параметров клинического анализа крови при температуре хранения 35° C (в сравнении с исходным образцом (0 ч.); % смещения;

интервал 95% ДИС для образцов при времени хранения)

Обсуждение результатов

Крайне важным аспектом для поддержания высокого качества выполнения лабораторных исследований является знание о стабильности тестируемых показателей. На сегодняшний день опубликованы исследования надежности отсроченного гематологического анализа образцов цельной крови с ЭДТА в качестве антикоагулянта на широком спектре гематологических анализаторов [7-14]. Нами было обнаружено пять исследований на предмет аналитической стабильности гематологических параметров в зависимости от условий хранения образцов с использованием анализаторов компании Beckman Coulter [16-20]. Ни в одном из них не сообщалось о стабильности показателей CBC при хранении проб выше 30°C. При этом следует отметить, что средние значения высоких температур, как минимум двух месяцев в году – июля и августа, в месте проведения данного эксперимента превышают 31°C.

Согласно результатам нашего исследования содержание эритроцитов (RBC) и концентрация гемоглобина (HGB) оставались стабильными на протяжении как минимум 72 ч. независимо от выбора температурного режима хранения образцов. Поскольку среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH) является величиной, рассчитываемой через отношение концентрации гемоглобина (HGB) к количеству эритроцитов в литре крови (RBC), то стабильность этого эритроцитарного индекса четко объясняется полученными нами стабильными значениями концентрации гемоглобина и количества эритроцитов на протяжении 72 ч. хранения образцов при любом из примененных в данном исследовании температурных режимов. Наши результаты согласуются с выводами полученными авторами в отношении отсутствия достоверных изменений показателя MCH, RBC и HGB с использованием разных анализаторов: F. Imeri et al. в работе с Beckman Coulter LH 750 (Beckman Coulter, Miami, USA) [16], Joshi et al. при оценке стабильности проб на Sysmex XE-5000 (Sysmex, Kobe, Japan) [11] и исследование Oliveira L.R. et al. на ABX Pentra 60 (Horiba ABX Diagnostics, Montpellier, France) [14].

Анализ изменений другого эритроцитарного индекса – среднего корпускулярного объема эритроцита, MCV, выявил четкую закономерность в увеличении этого показателя с течением времени тем более, чем выше температура хранения. Так, стабильность MCV при комнатной температуре была гарантирована только в течение 12 ч., тогда как при 35°C – только 6 ч. Наши результаты отчасти согласуются с данными Bourner et al. о том, что MCV при комнатной температуре остается стабильным только в течение нескольких часов, независимо от анализатора [18]. Нами установлено, что наиболее длительно сохраняющаяся достоверность результатов измерения MCV определялась для образцов, которые хранились при 4°C – 48 ч. В схожем исследовании F. Imeri et al. установили, что стабильность MCV при 4°C составляла 10 ч. для Advia 120 (Bayer Diagnostics, Tarrytown, USA), 24 ч. для Sysmex XE-2100 (Sysmex, Kobe, Japan) и 48 ч. для LH 750 [16].

Гематологический параметр, связанный прямо пропорционально с величиной MCV – гематокрит (HCT), статистически значимо менялся вслед за увеличением среднего объема эритроцитов при хранении свыше 24 ч. при комнатной температуре, более 6 ч. при 35°C и оставался стабилен 72 ч. в условиях хранения образцов при 4°C. Несколько ранее опубликованных исследовательских работ подтверждают, что гарантировать сохранность значений гематокрита в течении 72 ч. может только охлаждение проб цельной крови до 4-8°C. Однако время хранения для поддержания стабильности гематокрита при 4°C у разных авторов различается: LH 750 и Sysmex XE-5000 до 72 часов, Sysmex XE 2100 до 48 часов и Advia 120 только до 24 часов [11, 16].

Средняя концентрация гемоглобина в клетке, MCHC, находясь в обратной зависимости от MCV, показала в нашем исследовании заметное снижение при температуре 22 C и 35 C уже через 3 ч. от момента забора крови в вакутейнеры. При 4°C MCHC демонстрировал среднее смещение менее максимально допустимого отклонения в течение не менее 24 ч.

Отклонения в значениях таких параметров, как MCV, MCHC и HCT при хранении образцов цельной крови являются отражением процессов изменения морфологии эритроцитарной популяции с течением времени. Результаты исследовательской работы Arie Rahmnitarini et al. показали, что морфология эритроцитов начала меняться после 8 часов хранения при комнатной температуре [21]. Данный патофизиологический процесс зарубежными авторами обозначается как кренация эритроцитов и измеряется по шкале Turgeon [22]. Кренация эритроцитов, хранившихся при комнатной температуре, была более выраженной по сравнению с 4°C. Сфероциты были обнаружены при комнатной температуре после 16 часов хранения, а при температуре 4°C – после 24 ч. Морфологические изменения происходили в результате потери липидов мембраны эритроцитов и усиления её жесткости. Как следствие наблюдалось увеличение размера клеток с образованием сфероцитов и кренация.

Кроме физических факторов, на функциональные и морфологические характеристики эритроцитов влияет также применение антикоагулянта в вакутейнерах для сбора образцов крови. Rodak et al. утверждают, что ЭДТА вызывает необратимые повреждения структурных элементов, биохимических процессов и функциональных свойств всех клеток крови [23], что, в том числе, приводит к кренации и формированию эхиноцитов. Rodak et al. указывает, что хранение образцов крови с ЭДТА в качестве антикоагулянта даже при температуре хранения 4-8°C в течение 72 часов вызывает морфологические изменения в эритроцитах и приводит к их чрезвычайной осмотической нестабильности. Изменение проницаемости цитоплазматической мембраны эритроцитов приводит к перераспределению моновалентных катионов натрия и калия между внутриклеточной и внеклеточной средой, с усилением поглощения молекул воды, что вызывает расширение клеток и увеличение их среднего объема (MCV) [24].

Отображением нарушения морфологии эритроцитов является также нарастание анизоцитоза в виде достоверного увеличения значений показателей RDW и RDW-SD, отмеченного в нашей работе. Разность в осмотической стабильности отдельных эритроцитов, связанная, вероятно, с возрастом клеток и наличием повреждений мембраны или внутриклеточных структур, тем более проявляется в условиях хранения образцов в пробирках с ЭДТА. RDW (%), показатель гетерогенности эритроцитов по объему, в нашем эксперименте достоверно увеличивался уже через три часа хранения крови при комнатной температуре или 35°C. В условиях хранения при 4°C RDW оказался стабилен на протяжении 48 ч. Подобным образом нами отмечены смещения выше допустимого порога и для RDW-SD. Аналогично, Oliveira L.R. et al. с использованием ABX Pentra 60 установили стабильность RDW только для образцов, хранившихся при 4°C до 48 часов [14]. Между тем, в том же исследовании при комнатной температуре RDW показал аналитическую неточность во все анализируемые периоды времени. Daves et al., анализируя пробы на Sysmex XN, продемонстрировали статистически значимые изменения RDW через 24 часа как для комнатного режима сохранения образцов, так и при 4°C [10].

Таким образом, в нашем эксперименте MCV, HCT, MCHC, RDW и RDW-SD оказались гематологическими параметрами весьма чувствительными к условиям хранения. Напротив, RBC, HGB и MCH продемонстрировали стабильность на протяжении всего исследования, длящегося 72 ч. Исходя из этого, можно заключить, что для образцов с отсроченным выполнением клинического анализа крови MCH, RBC и HGB должны рассматриваться как более достоверные показатели для интерпретации анемии вместо MCV, HCT, MCHC, RDW и RDW-SD.

Существенные изменения морфологии эритроцитов, возникающие при хранении образцов цельной крови с ЭДТА, необходимо также учитывать при выполнении эритроцитометрии с построением кривой Прайс-Джонса. Данный анализ характеризует распределение эритроцитов по диаметру, являясь графическим отражением анизоцитоза. Можно утверждать, что высока вероятность получить недостоверные результаты эритроцитометрии с увеличением времени хранения проб крови.

Что касается количества лейкоцитов (WBC), то при комнатной температуре и охлаждении образцов этот показатель незначительно и приемлемо изменялся до 72 ч. Для проб, хранившихся при 35°C, содержание лейкоцитов демонстрировало статистически значимое снижение медианы через сутки от начала эксперимента и дольше, хотя не превышало максимально допустимого смещения (bias) в 5,6% до семидесяти двух часов (табл. 6). Полученные в ходе нашей работы результаты согласуются с предыдущей оценкой изменчивости гематологических параметров при хранении проб, выполненной на нескольких гематологических анализаторах: Beckman Coulter LH 750, Bayer Advia 120, Sysmex XE 2100 и Sysmex XE-5000, когда авторы обнаружили, что количество лейкоцитов существенно не менялось в образцах, хранившихся при 4°C вплоть до 72 ч. [11,16]. Однако при комнатной температуре существует разница результатов: так, параметр WBC на Beckman Coulter LH 750 имел стабильность до 72 ч., на Advia 120 – 48 ч., на Sysmex XE 2100 – 24 ч., и Sysmex XE-5000 со стабильностью до 72 часов [11, 16].

В нашей работе при оценке изменчивости количества тромбоцитов на гематологическом анализаторе при хранении проб в любом из примененных температурных режимов не регистрировались статистически значимые сдвиги значений показателя PLT. Полученные нами результаты отличаются от заключений, приводимых в опубликованных ранее работах: параметр PLT был стабилен от 24 ч. (LH 750 и Advia 120) до 48 ч. (Sysmex XE 2100) при комнатной температуре [16]. Примечательно, что в этом же исследовании при изменении температуры хранения до 4°C стабильность не меняется строго в одном направлении: в охлажденных образцах стабильность PLT была либо ниже (Sysmex XE 2100; 4 ч.), либо равна (LH 750), либо выше (Advia 120; 72 ч.) значений, полученных при комнатной температуре. В совокупности эти результаты показывают, что не только время и температура хранения, но и принцип измерения влияют на стабильность образца.

В другой работе, Oliveira L.R. et al. наблюдали неприемлемое процентное отличие от исходного уровня количества тромбоцитов с использованием анализатора ABX Pentra 60 как при комнатной температуре с 24 ч., так и при 4°C с 48 ч. [14].

MPV в нашей работе демонстрировал неприемлемое смещение результатов во всех трех режимах хранения: неожиданно раньше всего, с 6 ч. от начала эксперимента – при 4°C, в образцах, подвергавшихся нагреву с 12 ч. и с 48 ч. при комнатной температуре. Нестабильность MPV также наблюдалась в предыдущих исследованиях как при комнатной температуре, так и при 4°C и нагревании проб [12,14,16].

Поскольку в анализаторе UniCel DxH 800 MPV определяется непосредственно на основе анализа кривой распределения количества тромбоцитов, полученной методом импеданса, то возможным объяснением достоверного увеличения этого параметра при 4°C раньше, чем при комнатной температуре или даже нагревании до 35°C, может являться повреждение нормальной морфологии тромбоцитов при хранении, вызванное холодом. В условиях низких температур форма тромбоцитов меняется от дисковидной до сферической, с появлением игольчатых выступов на поверхности тромбоцитов [25].

Результаты настоящего исследования согласуются с предыдущими данными, демонстрирующими увеличение MPV при оценке импедансным методом как следствие повреждений при хранении [26]. Напротив, при оценке среднего объема тромбоцитов оптическим методом величина MPV снижается, вероятно, из-за разбавления цитоплазматического содержимого и, как результат – уменьшения коэффициента преломления [26].

Заключение

Cогласно рекомендации ICSH [27], образцы крови должны обрабатываться через 4-8 часов после забора. Однако в повседневной практике централизованной клинической лаборатории периодически возникают ситуации, приводящие к отсроченному выполнению клинического анализа крови в связи с нарушением времени транспортировки, техническими неисправностями гематологического оборудования и другими причинами. Настоящее исследование демонстрирует важность знаний о надежности результатов измерений в пределах 72 часов хранения при разных условиях. Температура хранения при 35°C вызывала самые существенные изменения, как минимум, по семи протестированным параметрам. Следует учитывать данный аспект в странах с высокими температурами окружающей среды, что делает необходимым использование систем охлаждения для транспортировки образцов на большие расстояния. Таким образом, в результатах проб, измеренных с задержкой во времени, могут обнаруживаться изменения, не отражающие фактическое состояние здоровья человека. Это может приводить к затруднениям или даже ошибкам в принятии врачом клинического решения, поэтому, полагаем, что в отчете по результатам клинического анализа крови тех проб, которые доставлены в централизованную лабораторию с нарушением преаналитического этапа, может быть оставлен комментарий для курирующего врача с целью осторожной интерпретации результатов гемограммы.