Изучение влияния комплексных соединений хлорида цинка на систему гемостаза и реологические показатели крови

Авторы

Автор для корреспонденции

Финансирование

Конфликт интересов

Поступила

Принята к печати

Аннотация

Ключевые слова

Для цитирования

DOI

Введение

Цинк является эссенциальным микроэлементом, выступающим в качестве кофактора более 300 энзимов. В составе почти 10% человеческого протеома цинк выполняет каталитические, структурные и регуляторные функции, оказывая антигипоксические, антиоксидантные, противовоспалительные, противомикробные, гемостатические эффекты. Цинк стимулирует клеточную пролиферацию и миграционную активность, способствуя репаративной регенерации на всех этапах ранозаживления: гемостаз, воспаление, пролиферация и ремоделирование. Дефицит цинка ассоциирован с кровоточивостью и нарушениями свертывания крови, что указывает на его ключевую роль в гемостазе и тромбозе [11]. Активированные тромбоциты высвобождают Zn²⁺ из гранул, за счет чего локальная концентрация цинка в зоне формирующегося тромба возрастает и становится достаточной для модуляции тромбоцитарных рецепторов и плазменных белков [17].

Ионы цинка связывают множество плазменных белков (фибриноген, высокомолекулярный кининоген, гистидин‑богатый гликопротеин и др.), изменяя их структуру и функциональную активность в свертывании и фибринолизе [16]. Экзогенный цинк в субмиллимолярных концентрациях способен индуцировать агрегацию тромбоцитов через фибриногеновый рецептор (αIIbβ3) и усиливать ответ на субпороговые стимулы (АДФ, коллаген), тем самым поддерживая формирование первичной тромбоцитарной пробки [19].

Известно, что ионы цинка участвуют в активации фактора XII. В частности, показано, что связывание и активация FXII на поверхности стимулированных тромбоцитов является Zn²⁺‑зависимым и необходимо для FXII‑зависимой генерации тромбина [5]. Цинк также изменяет активность ряда факторов свертывания (например, VIIa, XI, XII) и их взаимодействие с кофакторами и сосудистыми поверхностями, тем самым тонко регулируя скорость и локализацию тромбиногенеза [17]. Zn²⁺ связывается с фибриногеном и фибрином, влияет на ультраструктуру и механическую прочность фибриновой сети, изменяя толщину волокон, плотность сети и устойчивость сгустка к механическим и ферментативным воздействиям. Цинк способен модифицировать взаимодействие фибрина и гликозаминогликанов, а также функциональную активность регуляторов фибринолиза, что отражается на скорости лизиса тромба [17]. При системных воспалительных состояниях и инфекциях (включая COVID‑19) изменения цинкового статуса и локальной Zn²⁺‑сигнализации рассматриваются как фактор, способный как усиливать, так и ограничивать тромбообразование в зависимости от микросреды [3].

Известно, что дефицит цинка ассоциирован с повышенной жесткостью мембраны эритроцитов, снижением их деформируемости и увеличением вязкости цельной крови при одинаковом гематокрите [6]. Экспериментальные и клинические работы показывают, что снижение цинка в эритроцитах ухудшает их реологические свойства за счет изменения липидного слоя мембраны, белков спектрина и усиления оксидативного стресса [6]. В тоже время добавление цинка in vitro или пероральная коррекция дефицита повышают деформируемость эритроцитов и снижают рост вязкости крови при нагрузке, в том числе у спортсменов [20]. Оптимальный уровень цинка поддерживает нормальную деформируемость эритроцитов и умеренную вязкость крови, обеспечивая адекватный микрокровоток [8]. Дефицит цинка, повышая вязкость крови, парадоксально может снижать тромбообразование, а избыток цинка усиливает тромбоцитарную реактивность, агрегацию и стабилизацию фибринового сгустка, повышая риск тромбозов [20].

Таким образом, цинк влияет на реологию крови разнонаправленно: при дефиците он ухудшает деформируемость эритроцитов и повышает вязкость, при умеренном повышении уровня улучшает текучесть, а при избытке усиливает тромбоцитарную агрегацию и склонность к тромбозу [8].

Проведённые нами доклинические исследования оригинальных отечественных комплексов цинка с N-алкенилимидазолами позволили выявить комплекс диацетата цинка Пилим-1 с выраженными ранозаживляющими, противовоспалительными, антимикробными, анальгезирующими и антигипоксическими свойствами [7]. Учитывая важную роль гемостаза в ранозаживлении и актуальность поиска новых эффективных средств для профилактики и лечения тромбоза, цель нашего исследования – изучение влияния новых комплексных соединений хлорида цинка с N‑алкенилимидазолами на систему гемостаза и реологические показатели крови.

Материалы и методы исследования

Цинковые комплексы с N-алкенилимидазолами представляют собой координационные соединения Zn (II) с имидозольным лигандом, несущим алкенильный заместитель на атоме азота [1]. Алкенильный заместитель увеличивает липофильность и влияет на упаковку в кристалле и возможное образование координационных полимеров или димеров [13]. Цинковые комплексы с N-алкенилимидазолами показали антигипоксическое, антиоксидантное, противовоспалительное, ранозаживляющее, антиульцерогенное и анальгезирующее действие [1][7][9]. Они обладают высокой биодоступностью, хорошей переносимостью и рассматриваются как перспективная платформа для фармакотерапии состояний, связанных с нарушением репаративной регенерации и тканевой гипоксией [10].

Изученные нами вещества синтезированы в Иркутском институте химии имени А.Е. Фаворского и представлены в таблице 1.

В качестве референтных препаратов использовали ацетилсалициловую кислоту (АСК) (Шандонг Ксинхуа Фармасьютикал Кою, ЛТД, Китай), пентоксифиллин (ОАО «Дальхимфарм», Россия) и гепарин натрия (ОАО «Синтез», Россия).

Таблица 1. Комплексные соединения хлорида цинка с N-алкенилимидазолами

Ацетилсалициловая кислота (АСК) – наиболее распространенный и широко используемый нестероидный противовоспалительный препарат (НПВП) с анальгетическим, жаропонижающим и выраженным антиагрегантным действием, основанным на необратимом ингибировании

Пентоксифиллин – метилксантиновый неселективный ингибитор фосфодиэстеразы (ФДЭ) с иммуномодулирующим, антиоксидантным и противовоспалительным действием, улучшает микроциркуляторные процессы и реологические свойства крови за счет уменьшения вязкости [4][15][18].

Препарат обладает антиагрегантным действием, снижая синтез тромбоксана, увеличивая образование простациклина, уменьшая агрегацию тромбоцитов и их адгезию к сосудистой стенке [2]. Пентоксифиллин уменьшает активацию и адгезию лейкоцитов, экспрессию молекул адгезии на эндотелии, пролиферацию лимфоцитов и моноцитов, а также миграцию лейкоцитов, ингибирует пролиферацию фибробластов и синтез коллагена и компонентов межклеточного матрикса, оказывая, таким образом, антифибротический эффект [2].

Гепарин натрия является парентеральным прямым антикоагулянтом, представляющий смесь сульфатированных гликозаминогликанов. Применяется для профилактики и лечения тромбозов за счёт усиления активности антитромбина III и инактивации тромбина (IIa) и фактора Xa [14].

Исследуемые комплексы хлорида цинка и препараты сравнения для определения влияния на функциональную активность тромбоцитов и антикоагуляционную активность применяли в конечных концентрациях 2х10^-3 моль/л и 5х10^-4 г/мл соответственно. Исследование было одобрено этическим комитетом Сеченовского Университета (протокол № 25-25 от 15.12.2025 г.).

Исследование системы гемостаза. Эксперименты по изучению системы гемостаза проведены in vitro на крови здоровых мужчин-доноров 18-25 лет. Кровь забирали из кубитальной вены. Тесты проводили на обогащенной и обедненной тромбоцитами плазме, которую получали центрифугированием цитратной крови при 1000 об/мин 10 минут и при 3000 об/мин в течение 20 минут соответственно.

Влияние соединений хлорида цинка на агрегацию тромбоцитов, индуцированную аденозиндифосфатом (АДФ), оценивали по максимальной амплитуде, скорости агрегации, времени достижения максимальной амплитуды и дезагрегации тромбоцитов. При коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов оценивали латентный период активации фосфолипазы С и образования вторичных посредников, приводящих к образованию тромбоцитарных гранул и синтезу тромбоксана А₂.

Активацию тромбоцитов оценивали по изменению экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов цитофлуориметрическим методом (NovoCyte, Agilent, США). В образцы обогащенной тромбоцитами плазмы, разведенные в 100 раз 0,15 М фосфатно-солевым буферным раствором рН 7,0-7,5, вносили исследуемые вещества и инкубировали в течение 5 минут. Для активации тромбоцитов в пробы добавляли АДФ до конечной концентрации 20 мг/кг и перемешивали. Через 15 минут клетки фиксировали добавлением 1% раствора формалина и окрашивали мышиными моноклональными антителами CD62, меченными APC (алофикоцианином) (Becton Dickinson, США). «Тромбоцитарное окно» выделяли по параметрам прямого (FCS) и малоугольного (SSC) светорассеяний в логарифмической шкале координат с оценкой позитивных (%) по CD62 клеток.

Антикоагуляционную активность определяли клоттинговыми тестами на турбидиметрическом гемокоагулометре Solar CGL 2110 (ЗАО «СОЛАР», Россия). Определяли показатели активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ), протромбинового времени (ПВ), концентрацию фибриногена.

Все исследования проведены с использованием тестов производства «Технология-Стандарт», г. Барнаул, Россия.

Исследование микроциркуляции проводили в области кожи задней конечности крысы с использованием лазерного анализатора кровотока ЛАКК-М (НПП «ЛАЗМА», Россия) методом допплеровской лазерной флоуметрии (ЛДФ), широко используемым в медицине. Использование лазерного анализатора кровотока ЛАКК-М для комплексного исследования состояния микроциркуляторного обеспечения тканей позволяет осуществлять объективную регистрацию параметров микрогемодинамики и транспорта кислорода при воздействии биологически активных веществ. Вычисляли уровень перфузии ткани (ПМ) в перфузионных единицах (пф. ед.), среднее квадратичное отклонение, характеризующее временную изменчивость потока эритроцитов (σ или флакс, пф. ед.), а также соотношение между изменчивостью перфузии (флаксом) и средней перфузией (ПМ), выражаемое в коэффициенте вариации (Kv) – показателе вазомоторной активности микрососудов. С помощью вейвлет-анализа (программа 2.2.0.507, НПП «Лазма», Россия) определяли амплитуды колебаний кровотока (А, пф. ед.) активного тонусформирующего диапазона частот (эндотелиального NO-зависимого 0,0095-0,02 Гц, нейрогенного симпатического 0,02–0,046 Гц, миогенного 0,07–0,15 ГЦ) и амплитуды колебаний в пассивных частотных диапазонах (дыхательного 0,2–0,4 Гц и сердечного 0,8–1,6 Гц) [21].

Методом оптической оксигенации определяли индекс перфузионной сатурации кислорода в крови (Sm) и параметр удельного потребления кислорода в ткани (U). Данные показатели отражают связь между движущимся потоком крови (перфузией) и сатурацией крови и находятся в обратной зависимости от скорости потребления тканью кислорода и общим потреблением кислорода циркулирующей крови соответственно [22]. Также определяли относительный объем фракции эритроцитов в области исследования.

Полученные данные обработаны с применением статистического пакета Statistica 10.0 (StatSoft Inc, США). Нормальность результатов проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Так как вид распределения отличался от нормального, в работе использовались непараметрические методы. Данные представлены в виде медианы, 25 и 75 процентилей. Для дисперсионного анализа использовали критерий Краскела-Уоллиса. Различия считали достоверными при р ≤ 0,05.

Результаты исследования

Результаты сравнительного изучения влияния комплексных соединений хлорида цинка на систему гемостаза представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2. Влияние комплексных соединений хлорида цинка и референтных препаратов на систему гемостаза в условиях in vitro, Me (0,25–0,75)

Таблица 3. Экспрессия CD62 тромбоцитов в присутствии комплексных соединений хлорида цинка и референтных препаратов, Ме (0,25-0,75)

Из таблицы 2 видно, что изученные соединения влияли на плазменный компонент системы гемостаза, что проявлялось в изменении показателя внутреннего пути свертывания крови – АПТВ, не изменяя при этом показатель концентрации фибриногена и ПВ. Вещества Аллил-Cl и Аллил-2-Сl проявили антиагрегационную активность на уровне АСК, увеличивая при этом lag-период более эффективнее, чем АСК. Изученные комплексы хлорида цинка полностью подавляли активацию тромбоцитов в изученных концентрациях в отличие от АСК.

Система микроциркуляции

Исследования по изучения влияния комплексных соединений цинка на систему микроциркуляции проведены на 40 крысах-самцах Wistar массой 300-350 г.

Влияние на микрогемодинамику. В контрольной группе животных показатели интенсивности микроциркуляции были следующие: ПМ – 15,6±2,44 пф. Ед., σ – 4,7±0,72 пф. Ед., Кv – 46,3±7,10 усл. ед. (Таблица 4).

Через 1 час после в/б введения Аллил-Сl увеличивались показатели ПМ, уровня флакса на 28% и 35% соответственно и снижался Кv на 25% по сравнению с контрольными значениями (р ≤ 0,05). Введение Аллил-2-Cl приводило к статистически значимому увеличению ПМ и уровня флакса на 25% и 46% соответственно и не изменяло Кv по сравнению с контрольными значениями (р ≤ 0,05). Увеличение уровня перфузии тканей и флакса при введении комплексных соединений хлорида цинка указывает на их способность улучшать микроциркуляцию и механизмы модуляции тканевого кровотока. Ацизол-Cl и Пропаргил-Cl не изменяли данные показатели микрогемодинамики.

Влияние на тканевую оксигенацию. В контрольной группе животных сатурация кислородом смешанной крови (SO₂) достигала 69,0±4,70%, а среднее значение перфузии (М), характеризующее содержание кислорода в смешанной крови микроциркуляторного русла, не превышало 60,6±4,2%. Индекс перфузионной сатурации кислорода в крови (Sm) составлял 4,8±0,58 усл. ед. Из исследуемого объема крови утилизировалось 1,9±0,39 усл. ед. кислорода (Таблица 5).

Таблица 5. Влияние комплексных соединений хлорида цинка на тканевую оксигенацию (n = 8)

При введении Аллил-Сl показатель SO₂ повышался на 24% и усиливалась утилизация кислорода в тканях, о чем свидетельствует увеличение на 26% показателя U. Введение Аллил-2-Cl не изменяло SO₂ и приводило к увеличению U на 25%. Показатель М не изменялся при введении обоих соединений, а Sm уменьшался на 30 (Аллил-Сl) и 16% (Аллил-2-Cl) по сравнению с контролем. При введении соединений Ацизол-Cl и Пропаргил-Cl существенных изменений показателей тканевой оксигенации выявлено не было. При введении Аллил-Сl увеличивался параметр эффективности кислородного обмена (ЭКО) на 25% (Таблица 6).

Таблица 6. Влияние комплексных соединений хлорида цинка на Vr и ЭКО (n=8)

Изученные нами комплексные соединения хлорида цинка спустя 1 час после в/б не изменяли амплитуду эндотелиальных (Аэ) колебаний, Аллил-Сl и Аллил-2-Cl статистически значимо увеличивали амплитуду нейрогенных колебаний (Ан), амплитуду миогенных колебаний (Ам), амплитуду дыхательных колебаний (Ад) и амплитуду пульсовых колебаний (Ап) на 20 и 15%, 35 и 27%, 33 и 30%, 29 и 28% соответственно по сравнению с контрольной группой животных (Рисунок 1).

Рисунок 1. Влияние комплексных соединений хлорида цинка на показатели микроциркуляции у крыс

Обсуждение результатов

Полученные результаты демонстрируют, что комплексные соединения хлорида цинка с N-алкенилимидазолами не только лишены ожидаемого проагрегантного эффекта свободного цинка, но и проявляют выраженное антиагрегантное и антикоагулянтное действие, сопоставимое или превосходящее референтные препараты. Это позволяет рассматривать их как перспективные модуляторы гемостаза с дополнительным влиянием на микроциркуляцию и тканевую оксигенацию.

Особенно значимым является полное подавление активации тромбоцитов (экспрессии CD62P) всеми цинковыми комплексами как в условиях стимуляции АДФ, так и без нее, в то время как АСК снижала активацию лишь частично.

Изученные нами комплексные соединения хлорида цинка спустя 1 час после в/б не изменяли амплитуду эндотелиальных (Аэ) колебаний, Аллил-Сl и Аллил-2-Cl статистически значимо увеличивали амплитуду нейрогенных колебаний (Ан), амплитуду миогенных колебаний (Ам), амплитуду дыхательных колебаний (Ад) и амплитуду пульсовых колебаний (Ап) на 20 и 15%, 35 и 27%, 33 и 30%, 29 и 28% соответственно по сравнению с контрольной группой животных (Рисунок 1).

Следовательно, изменения в системе микроциркуляции, наблюдаемые под воздействием комплексных соединений хлорида цинка, способствуют повышению гипоксической устойчивости тканей. При этом улучшаются микрогемодинамика, показатели ЭКО, U и увеличивается содержание эритроцитов в микроциркуляторном русле. Увеличение кислородной емкости крови путем активации эритропоэза способствует росту ЭКО, а повышение U, возможно, вызвано ускорением диссоциации оксигемоглобина в тканях. Перечисленные изменения приводят к экономичному функционированию органов и тканей и повышению эффективности метаболизма.

Это указывает на иной, чем у АСК, механизм воздействия, затрагивающий ранние этапы тромбоцитарной активации и дегрануляции, что потенциально может уменьшать тромбовоспалительные взаимодействия тромбоцитов с лейкоцитами и эндотелием.

В условиях in vitro все изученные комплексы удлиняли АПТВ, не изменяя протромбиновое время и концентрацию фибриногена, что указывает на преимущественное влияние на внутренний путь свертывания без выраженного риска гипофибриногенемии. При этом Аллил-Cl и Аллил-2-Cl по антиагрегационной активности не уступали АСК, но более значительно увеличивали lag‑период, замедляя инициацию агрегации.

Несмотря на известную способность свободных ионов Zn²⁺ усиливать агрегацию тромбоцитов через рецептор GPIIb/IIIa и модификацию плазменных белков, комплексы Аллил‑Cl и Аллил‑2‑Cl демонстрируют противоположный эффект, что можно объяснить лиганд-опосредованной модуляцией биодоступности и распределения цинка. Связь Zn (II) с N-алкенилимидазолом, вероятно, ограничивает прямое взаимодействие катиона с рецепторами GPVI и GPIIb/IIIa, стабилизирует мембраны тромбоцитов и ослабляет Ca²⁺‑зависимые сигнальные пути, критические для дегрануляции и экспрессии P‑селектинa.

Дополнительный вклад могут вносить антиоксидантные и мембраностабилизирующие свойства этих комплексов, ранее показанные для N‑алкенилимидазольных производных цинка, что снижает оксидативно опосредованную активацию тромбоцитов и эндотелия. В результате формируется мягко выраженный антикоагулянтный и антиагрегантный профиль без глубокого подавления плазменного звена гемостаза, что потенциально снижает риск кровотечений по сравнению с классическими антикоагулянтами.

Через 1 час после введения Аллил‑Cl и Аллил‑2‑Cl отмечено достоверное увеличение перфузии и флакса, отражающее усиление микроциркуляторного кровотока при сохранении или умеренном снижении коэффициента вариации, что свидетельствует об оптимизации вазомоторной активности микрососудов. Такие изменения указывают на улучшение распределения кровотока в микрососудистом русле и снижение выраженности стазов и спазмов. Аллил‑Cl и Аллил‑2‑Cl также повышали утилизацию кислорода тканями (рост U) при одновременном увеличении SO₂ и ЭКО, что говорит об улучшении обеспечения кислородом и более экономичном его использовании. Отсутствие значимых сдвигов при введении Ацизол‑Cl и Пропаргил‑Cl показывает структурную избирательность эффекта и подчёркивает роль аллильных заместителей в реализации вазоактивного и антигипоксического действия.

Вейвлет‑анализ показал усиление нейрогенных, миогенных, дыхательных и пульсовых колебаний под влиянием Аллил‑Cl и Аллил‑2‑Cl, что отражает активизацию регуляторных звеньев микроциркуляции при отсутствии влияния на метаболические процессы эндотелия, связанные с релизингом оксида азота.

Совокупность данных по микрогемодинамике, оксигенации и колебательным компонентам кровотока указывает на формирование состояния повышенной гипоксической устойчивости тканей под влиянием производных N‑алкенилимидазолов. Повышение ЭКО, U и содержания эритроцитов в микроциркуляторном русле может быть связано как с улучшением реологических свойств крови, так и с увеличением кислородной емкости за счет активации эритропоэза.

Сочетание антиагрегантного действия, слабого антикоагуляционного эффекта и улучшения микроциркуляции делает комплексные соединения хлорида цинка с N‑алкенилимидазолами потенциально перспективными для профилактики и лечения тромбозов, особенно на фоне нарушений микроциркуляции и тканевой гипоксии. В отличие от АСК и гепарина, эти соединения не вызывают глубоких изменений традиционных плазменных показателей свертывания и одновременно улучшают кислородный обмен в тканях, что может быть важно при хронических ишемических и раневых процессах.

Однако полученные данные относятся к моделям in vitro и острого введения животным, поэтому необходимы дополнительные исследования фармакокинетики, безопасности и эффективности при длительном применении, а также сравнение с современными антиагрегантами и антикоагулянтами. В дальнейшем особый интерес представляют работы по уточнению молекулярных мишеней и возможной органопротективной роли этих комплексов в условиях системной гипоксии и воспаления.

Выводы

Сочетание слабого антикоагуляционного эффекта, выраженного подавления активации тромбоцитов и улучшения микроциркуляции позволяет рассматривать комплексные соединения хлорида цинка производные N‑алкенилимидазолов как потенциальные кандидаты для профилактики и лечения тромботических осложнений, особенно на фоне микроциркуляторных и гипоксических нарушений, что требует дальнейших доклинических и клинических исследований.

Вклад авторов

Список литературы

Research on the impact of zinc chloride complexes on the hemostasis system and blood rheological characteristics

Authors

Corresponding Author

Conflict of interest

Funding

Received

Accepted for publication

Abstract

Key words

DOI

References