Введение

Современные требования к производству и контролю качества лекарственных средств предписывают обеспечить полноценную и всестороннюю оценку новых фармацевтических субстанций (ФС) на стадии фармацевтической разработки.

Новая фармацевтическая субстанция кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой (эмпирическая формула С₁₆Н₂₀N₂O₂) была синтезирована в ООО "БЕЛФАРМАМЕД" (рис.1). Установлено, что данная субстанция в дозе 50 мг/кг/сут проявляет наиболее выраженный кардиопротективный эффект по сравнению с эналаприлатом, 5 мг/кг; верапамилом, 5 мг/кг; карведилолом, 30 мг/кг, что выражается в улучшении показателей сократимости на доксорубициновой модели кардиомиопатий [1].

Рис. 1. Структурная формула кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой.

Кислота 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновая представляет собой порошок белого или почти белого цвета. Он растворим в 96% спирте, мало растворим в хлороформе, практически не растворим в воде. Температура плавления составляет от 252°С до 258°С (с разложением).

Для вновь созданной молекулы с доказанным фармакологическим эффектом необходимо разработать нормы качества, отвечающие требованиям Государственной Фармакопеи Российской Федерации 14 издания. Согласно ОФС.1.1.0006.15, фармацевтические субстанции представляют собой лекарственные средства, состоящие из одного или нескольких действующих веществ, обладающих фармакологической активностью.

Важнейшим аспектом при определении вводимых показателей норм качества ФС, а также их пределов является назначение субстанции. Вновь разработанная субстанция кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой предназначена для изготовления нестерильных лекарственных препаратов. Таким образом, исходя из её физико-химических свойств и назначения были определены следующие показатели норм качества [2]:

Одними из наиболее важных показателей качества ФС, несоответствие которых нормам является критическим, являются подлинность и количественное определение. Ввиду того, что кислота 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой не является фармакопейной, требуется разработка нормативной документации, и, соответственно, адекватных методик определения качества нового лекарственного вещества.

Задачей настоящего исследования стала разработка и валидация методик определения подлинности и количественного определения кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой в фармацевтической субстанции.

Материалы и методы исследования

Объекты исследования: новая фармацевтическая субстанция кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой (М.м 272,35 г/моль), стандартный образец (СО) кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой (стандартный образец предприятия), аттестованный в соответствии с требованиями ОФС.1.1.0007.18. Стандартные образцы.

Растворители и реактивы: калия бромид (х.ч., ГОСТ 4160-74), кислота хлорная 70%-ная (х.ч., ТУ 6-09-2878), кислота уксусная ледяная (х.ч., ГОСТ 61-75), калий фталевокислый кислый (х.ч., ТУ 6-09-09-304).

Определение подлинности проводили с использованием ИК-спектрометра с Фурье-преобразователем Shimadzu FTIR 8300 (Япония) в диске с калия бромидом в соответствии с ОФС.1.2.1.1.0002.15. Спектрометрия в инфракрасной области. Количественное определение кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой проводили с использованием автоматического титратора Titroline 7000 ("SI Analytics", Германия).

Методика определения подлинности кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой

1-3 мг кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой, предназначенной для испытания, растирают с 150-200 мг тщательно измельченного и высушенного калия бромида. Смесь тщательно перетирают, добиваясь необходимой однородности, и прессуют диск при помощи гидравлического пресса в течение 2-5 мин.

Диск не пригоден для испытания, если в области прохождения луча на диске имеются трещины, или при визуальном осмотре он неоднороден по прозрачности, либо его пропускание при 2000 см-1 (5 мкм) составляет менее 60% без компенсации при отсутствии специфической полосы поглощения. Образец испытуемого вещества и стандартный образец готовят по одной и той же методике и записывают спектры в рабочей области прибора в одних и тех же условиях. Полосы поглощения в спектре испытуемого образца должны соответствовать по положению полосам поглощения в спектре стандартного образца.

Методика количественного определения кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой

0,15 г субстанции (точная навеска) растворяют в 30 мл кислоты уксусной ледяной и титруют 0,1 М раствором кислоты хлорной с использованием автоматического титратора с потенциометрической детекцией точки эквивалентности. Титрование проводят в трех повторностях. Параллельно проводят контрольный опыт (без добавления анализируемой субстанции). В качестве результата испытаний принимают среднее значение, полученное по результатам трех параллельных опытов.

Содержание (%) кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой в субстанции определяется по формуле:

Фармацевтическая субстанция содержит не менее 99,0% и не более 102,0% С₁₆Н₂₀N₂O₂ в пересчете на безводное вещество.

Результаты и обсуждение

Для определения подлинности кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой был использован метод ИК-спектроскопии как приоритетный метод при идентификации фармацевтических субстанций и рекомендованный Государственной Фармакопеей, согласно которой методики проверки подлинности подвергаются валидации при необходимости подтвердить их специфичность. После проведения пробоподготовки были получены спектры поглощения субстанции и стандартного образца (рис. 2,3).

Рис. 2. ИК-спектр субстанции кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой

Рис. 3. ИК-спектр СО кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой

Критерием приемлемости методики по показателю "Специфичность" является соответствие по положению полос поглощения в спектре испытуемого образца полосам поглощения в спектре стандартного образца. Полученные результаты свидетельствуют о совпадении характеристических полос поглощения субстанции и стандартного образца, и, соответственно, о приемлемости данной методики.

Количественное определение фармацевтической субстанции проводили методом кислотно-основного титрования в неводных средах. Применение в контроле качества лекарственных средств автоматических титраторов позволяет снизить случайные ошибки, вызванные работой оператора, а также значительно повышает точность и снижает время анализа. Объект исследования имеет слабые основные центры, которые не позволяют проводить титрование в воде, поэтому в качестве растворителя была использована кислота уксусная ледяная, в качестве титранта использовали раствор кислоты хлорной.

Рис. 4. Типичная кривая при титровании кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой.

На рисунке 4 представлена типичная титрограмма, формируемая программным обеспечением титратора Titroline 7000.

С использованием разработанной методики было проведено количественное определение содержания кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой в фармацевтической субстанции трех серий (табл. 1).

Таблица 1. Результаты количественного определения кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой в фармацевтической субстанции

Разработанная методика количественного определения кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой была валидирована в соответствии с современными требованиями (ОФС.1.1.0012.15 Валидация аналитических методик). При валидации проведена оценка аналитической методики по следующим характеристикам:

Специфичность – это способность аналитической методики однозначно оценивать определяемое вещество в присутствии сопутствующих компонентов.

При титровании холостого раствора (ледяной уксусной кислоты) объём раствора титранта, который был израсходован на титрование без добавления навески анализируемой субстанции составлял 0,01 мл – 0,02 мл, что составляет 0,2-0,4% от объёма титранта, необходимого для титрования 100% концентрации субстанции кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой при выполнении анализа согласно представленной методике, и сопоставимо с пределом допускаемой относительной погрешности вместимости бюретки (±0,15%), таким образом, разработанная методика специфична.

Аналитическая область методики – это интервал между верхним и нижним значением аналитических характеристик определяемого компонента в объекте анализа (его количества, концентрации, активности и т.п.). В этом интервале результаты, получаемые с использованием валидируемой методики, должны иметь приемлемый уровень правильности и внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности. К величине аналитической области методик предъявляются следующие требования: методики количественного определения должны быть применимы в интервале от 80 до 120% от номинального значения определяемой аналитической характеристики, должна наблюдаться линейная зависимость аналитического сигнала от концентрации или количества определяемого вещества в анализируемой пробе в пределах аналитической области методики (значение коэффициента регрессии R² должно составлять не менее 0,9970). Кроме того, методика характеризуется правильностью – отклонением среднего результата определений, выполненных с ее использованием, от значения, принимаемого за истинное.

Для оценки правильности методик количественного определения возможно использовать анализ с использованием валидируемой методики стандартных образцов или модельных смесей с известным содержанием (концентрацией) определяемого вещества с использованием метода добавок.

Ввиду того, что субстанция кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой является нефармакопейной, для исследования линейности был выбран расширенный диапазон 75% – 125% от номинального содержания субстанции в пробе, согласно методике (табл. 2).

Таблица 2. Результаты определения кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой методом добавок

На рисунке 5 представлена линейная зависимость объема титранта, пошедшего на титрование, от навески исследуемого соединения, значение коэффициента регрессии R составило 0,9998. Таким образом, линейность методики количественного определения ФС подтверждена.

Рис. 5. Линейная зависимость расхода титранта от навески субстанции

Правильность методики подтверждали методом добавок, результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты выполнения теста "Правильность" (метод добавок)

Критериями приемлемости методики по показателю "Правильность" являются следующие:

При валидации данной методики установлено, что доверительный интервал для добавки до 80% составил 100,10±0,29%, для добавки до 100% – 99,93±0,19%, для добавки до 120% – 100,20±0,12%. Доверительный интервал по 9 точкам, принадлежащим одной выборке данных, составил 100,08±0,07%. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о соответствии разработанной методики критерию правильности.

Прецизионность методики характеризуется рассеянием результатов, получаемых с ее использованием, относительно величины среднего результата. Мерой такого рассеяния является величина стандартного отклонения результата отдельного определения, полученная для выборки достаточно большого объема. Правильность изучали на повторяемости (сходимости) и промежуточной (внутрилабораторной) прецизионности.

Повторяемость аналитической методики оценивали по независимым результатам, полученным в одинаковых регламентированных условиях в одной лаборатории (один и тот же исполнитель, одно и то же оборудование, один и тот же набор реактивов) в пределах короткого промежутка времени.

Для подтверждения правильности был использован СО кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой, результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4. Результаты выполнения теста "Правильность"

Полученные результаты соответствуют критериям приемлемости – относительное стандартное отклонение составило 0,14% (норма – не более 2%), а также значение доверительного интервала не превысило установленные пределы содержания активного вещества в субстанции (99,0 – 102,0%).

Таким образом, подтверждена правильность разработанной методики.

Внутрилабораторная (промежуточная) прецизионность валидируемой методики оценивалась в условиях работы одной лаборатории в разные дни и разными исполнителями (табл. 5).

Таблица 5. Результаты установления внутрилабораторной прецизионности методики количественного определения С₁₆Н₂₀N₂O₂ (сотрудник А, день 1; сотрудник Б, день 2)

Критерии приемлемости показателя "Внутрилабораторная прецизионность" были также подтверждены: так, коэффициент вариации (относительное стандартное отклонение) составило менее 2% (0,23% и 0,26%), значение доверительного интервала в обоих случаях также не превысило установленные пределы содержания активного вещества в субстанции (99,0 – 102,0%).

Выводы

При разработке норм качества были разработаны и валидированы методики определения подлинности и количественного определения нового соединения, обладающего доказанной фармакологической активностью – кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой. Определение подлинности проводили методом ИК-спектроскопии, методика валидирована по критерию "специфичность"

Также разработана методика количественного определения кислоты 3-(1H-бензимидазол-2-ил)-1,2,2-триметилциклопентан-карбоновой методом неводного титрования с потенциометрической детекцией точки эквивалентности. Предложенная методика валидирована и пригодна к выполнению измерений в исследуемом диапазоне.